擬南芥4CL cDNA的克隆及其對酵母的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、本課題研究利用金磁微球法提取得到擬南芥總RNA，然后利用RT-PCR法克隆出4CL(4CL)基因cDNA序列，構(gòu)建了其克隆載體Pgem-Easy-4CL。通過測序?qū)ζ溥M(jìn)行序列分析后，進(jìn)一步構(gòu)建其畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5K.4CL，然后利用電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSll5，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)重組酵母表達(dá)，取得了如下進(jìn)展： 利用RT-PCR法從擬南芥中擴(kuò)增出4-香豆酸：輔酶A連接酶基因編碼序列，構(gòu)建了克隆載體Pgem-TEasy-4CL。

2、通過PCR和酶切初步鑒定J下確后，對其進(jìn)行測序，測序結(jié)果和NCBI中登陸號為NM_001 084228.1的4CLcDNA序列比對，同源性為99％。表明4-香豆酸：輔酶A連接酶基因已經(jīng)成功克隆并連接至克隆載體Pgem-Teasy中。 設(shè)計分別帶有BamtH和Not I兩個酶切位點的4-香豆酸：輔酶A連接酶基因引物，以Pgem-Teasy-4CL為模板，擴(kuò)增出5'端和3'端分別帶有BamHI和Not I兩酶切位點的4CL基因，然后

3、用這兩種酶切后連接至畢赤酵母表達(dá)載體pPlC3.5K中。重組表達(dá)載體Ppic3.5K.4CL。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a并利用其上攜帶的氨芐青霉素抗性基因篩選出抗性菌株，然后做PCR及雙酶切鑒定。經(jīng)鑒定4-香豆酸：輔酶A連接酶基因已經(jīng)準(zhǔn)確地連接到畢赤酵母表達(dá)載體Ppic3.5K中。 用電轉(zhuǎn)化法將重組酵母表達(dá)載體Ppic3.5K-4CL，導(dǎo)入甲醇型酵母(P.Pastoris)菌株GSll5中，獲得轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子采用營養(yǎng)缺陷、遺傳霉素、