擬南芥CBF1基因的克隆及其對(duì)香蕉胚性懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、香蕉(Musaspp.)是熱帶、亞熱帶地區(qū)最重要的農(nóng)作物之一，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。冷害已給香蕉的生產(chǎn)帶來(lái)了極大的威脅，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，培育出抗寒、抗凍的優(yōu)質(zhì)品種是香蕉產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的保證之一。常規(guī)育種因多數(shù)香蕉栽培種是三倍體而具有高度不育等特性而不易實(shí)現(xiàn)，而利用組織培養(yǎng)并結(jié)合基因工程技術(shù)可望實(shí)現(xiàn)這一目的。 針對(duì)以上問(wèn)題，本論文以本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的龍牙蕉(AAB)和貢蕉(AA)胚性懸浮系為基礎(chǔ)，從擬南芥中克隆抗寒相關(guān)基

2、因——CBF1基因并通過(guò)根癌農(nóng)桿菌的介導(dǎo)導(dǎo)入龍牙蕉胚性懸浮細(xì)胞和貢蕉胚性懸浮細(xì)胞，以研究該基因的轉(zhuǎn)化對(duì)上述香蕉抗寒性的影響。 根據(jù)GenBank中野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)CBF1基因的cds全序列，設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增出該基因的開(kāi)放讀碼框序列。同時(shí)，以pBA002和pCAMBIA2301質(zhì)粒載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建了中間載體(命名為pBACBF1)和表達(dá)載體(命名為pCAMBIA-CBF1)。pCAMBIA-

3、CBF1質(zhì)粒載體含在CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控下的CBF1基因的開(kāi)放讀碼框序列、GUS基因和NptⅡ基因。以根癌農(nóng)桿菌EHA105為媒介，轉(zhuǎn)化龍牙蕉胚性懸浮細(xì)胞和貢蕉胚性懸浮細(xì)胞，經(jīng)含50mg/L卡那霉素(Kan)和適當(dāng)濃度頭孢拉定(Cef)(在繼代過(guò)程中濃度由500mg/L降至200mg/L)的相應(yīng)的培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，獲得了擬轉(zhuǎn)基因龍牙蕉植株和貢蕉體胚。GUS基因表達(dá)的組織化學(xué)染色表明不同培養(yǎng)階段的龍牙蕉培養(yǎng)物均可顯藍(lán)色，表明GUS基因已