擬南芥懸浮細(xì)胞生物學(xué)及其遺傳轉(zhuǎn)化模式.pdf

1、本文從擬南芥懸浮細(xì)胞及其愈傷組織生物學(xué)特性研究入手，以期制備適合農(nóng)桿菌高效轉(zhuǎn)化的受體材料，并制定科學(xué)、合理、有效的轉(zhuǎn)化方案；利用所構(gòu)成的多個(gè)質(zhì)粒載體，進(jìn)行擬南芥懸浮細(xì)胞基因轉(zhuǎn)化，以檢驗(yàn)多種轉(zhuǎn)化方案的可行性，并優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件；檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)，以期建立有效的轉(zhuǎn)化模式，并獲得可利用的轉(zhuǎn)化材料。本論文所做的主要工作如下： 1、擬南芥懸浮細(xì)胞及其愈傷組織生長(zhǎng)特性與培養(yǎng)條件 試驗(yàn)研究了擬南芥懸浮細(xì)胞及其愈傷組

2、織的生長(zhǎng)特性及其繼代培養(yǎng)條件，旨在摸索維持?jǐn)M南芥懸浮細(xì)胞正常穩(wěn)定生長(zhǎng)的培養(yǎng)技術(shù)，并為擬南芥懸浮細(xì)胞進(jìn)一步的遺傳操作提供良好的受體材料和科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明，在每個(gè)7d一次的繼代周期中，擬南芥懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)表現(xiàn)明顯的S型生長(zhǎng)曲線。正常培養(yǎng)條件下，繼代后2-4d出現(xiàn)快速生長(zhǎng)時(shí)期，此后生長(zhǎng)量迅速下降，但接種量不同，其繼代后懸浮細(xì)胞生物量及快速增長(zhǎng)發(fā)生時(shí)期不同。維持7d繼代周期的理想接種量為起始懸浮液按10ml/50ml稀釋。接種量小，生長(zhǎng)遲緩，

3、甚至不能增殖。培養(yǎng)基中不同激素及不同蔗糖含量均會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生極明顯的影響，在B5+0.2mg/LNAA條件下反復(fù)繼代后的細(xì)胞，再加入外源NAA時(shí)，反而會(huì)抑制其生長(zhǎng)。蔗糖含量以30g/L最好；蔗糖含量低，懸浮生物量及細(xì)胞活性明顯下降。 擬南芥愈傷組織生長(zhǎng)也呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，正常條件下，需經(jīng)歷約各10d的誘導(dǎo)時(shí)期、快速生長(zhǎng)時(shí)期和生長(zhǎng)停滯及老化時(shí)期。愈傷組織誘導(dǎo)及其生長(zhǎng)對(duì)外界條件也特別敏感，一定的表面濕度及較低的培養(yǎng)溫度是必須的。

4、 2、擬南芥懸浮細(xì)胞及其愈傷組織對(duì)抗生素的反應(yīng) 試驗(yàn)研究了擬南芥懸浮及其愈傷組織對(duì)潮霉素、卡那霉素、頭孢霉素等3種抗生素的反應(yīng)，為擬南芥懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)化子抗生素選擇濃度和選擇方案的制定提供依據(jù)。結(jié)果表明：潮霉素對(duì)擬南芥懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)、愈傷組織誘導(dǎo)及其生長(zhǎng)均有極明顯的抑制作用，但作用效果和特性均有所不同。擬南芥懸浮細(xì)胞繼代培養(yǎng)階段、愈傷組織誘導(dǎo)階段和愈傷組織增殖階段的臨界致死濃度分別為25，2.5，1.5mg/L，液體與固體培養(yǎng)條件

5、下差異極大。當(dāng)采用潮霉素抗性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)，應(yīng)當(dāng)分別采用相應(yīng)階段的臨界致死濃度作為轉(zhuǎn)化子選擇濃度。與此同時(shí)，潮霉素需要一定處理時(shí)間才能充分表現(xiàn)其抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或殺死細(xì)胞的效果，一般液體培養(yǎng)條件下3d以后、固體培養(yǎng)條件下5d以后效果趨于穩(wěn)定，但不同的處理濃度有較大差異，建議選擇時(shí)間在液體培養(yǎng)條件下不少于3d，在固體培養(yǎng)條件下不少于5d。否則，假陽(yáng)性率會(huì)很高，從而大大加重后續(xù)轉(zhuǎn)化子檢測(cè)的工作量。 卡那霉素與潮霉素有類似的影響，在愈傷

6、組織誘導(dǎo)階段，適宜的選擇濃度為50mg/L，根據(jù)潮霉素作用特性推測(cè)，其在液體培養(yǎng)階段和愈傷組織生長(zhǎng)階段的適宜選擇濃度分別在100mg/L、25mg/L左右。后續(xù)的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，若利用卡那霉素選擇，我們將采用這一選擇濃度。 試驗(yàn)中意外發(fā)現(xiàn)頭孢霉素能促進(jìn)綠色懸浮細(xì)胞的獲得，并具有逆轉(zhuǎn)懸浮細(xì)胞“白化”的穩(wěn)定效果。有關(guān)懸浮細(xì)胞“白化”原因及頭孢霉素逆轉(zhuǎn)效應(yīng)機(jī)理，有待進(jìn)一步研究。 3、擬南芥懸浮細(xì)胞耐受性試驗(yàn) 選擇與其遺傳轉(zhuǎn)

7、化相關(guān)的常溫靜置、低溫靜置、高溫振蕩、蔗糖饑餓和常溫振蕩(對(duì)照)幾種不同處理方式，從其生長(zhǎng)和細(xì)胞活性兩個(gè)方面，研究其對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性，以更好地制定擬南芥懸浮細(xì)胞基因轉(zhuǎn)化時(shí)細(xì)胞同步化或預(yù)處理及共培養(yǎng)的方案和條件。結(jié)果表明：擬南芥懸浮細(xì)胞對(duì)各種脅迫處理的耐受性表現(xiàn)出明顯的差異，整體耐受性強(qiáng)弱依次為：常溫振蕩(對(duì)照)＞蔗糖饑餓＞高溫振蕩＞低溫靜置＞常溫靜置，常溫靜置最低。擬南芥懸浮細(xì)胞對(duì)脅迫處理的不適應(yīng)表現(xiàn)在多個(gè)方面，總生物量增長(zhǎng)很少或不能

8、增長(zhǎng)，細(xì)胞相對(duì)活性及活細(xì)胞生物量不斷下降，耐受系數(shù)低。隨著時(shí)間的變化，擬南芥懸浮細(xì)胞對(duì)脅迫處理的耐受性或不適應(yīng)性的表現(xiàn)呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，這種變化的可能機(jī)制與細(xì)胞間協(xié)同與競(jìng)爭(zhēng)、細(xì)胞自我適應(yīng)機(jī)制的調(diào)節(jié)等有關(guān)。 4、擬南芥懸浮細(xì)胞超低溫保存試驗(yàn) 探索一般實(shí)驗(yàn)室條件下擬南芥懸浮細(xì)胞的簡(jiǎn)便保存技術(shù)，為中長(zhǎng)期保存遺傳背景穩(wěn)定一致的擬南芥懸浮細(xì)胞起始材料提供有效的方法。通過(guò)一系列試驗(yàn)，本文獲得了擬南芥超低溫保存的適宜方法。優(yōu)化方案如

9、下：選擇繼代后2d的擬南芥懸浮細(xì)胞，洗滌1次，細(xì)胞沉淀重懸浮于6％蔗糖培養(yǎng)基，于4℃低溫下鍛煉6h；濃縮細(xì)胞使之有較高的細(xì)胞密度(0.25～0.30g/ml)，加入16％(W/V)甘油作為冰凍保護(hù)劑，直接置于-80℃深冷冰箱保存；使用時(shí)以37℃快速解凍，離心后除去保護(hù)劑，然后可用去離子水洗滌后進(jìn)行活性檢測(cè)，也可用基本培養(yǎng)基洗滌后重新進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。此方法保存30d后的細(xì)胞相對(duì)活性達(dá)0.8左右，可以滿足實(shí)驗(yàn)室一般研究用。如果對(duì)其保存后的活性

10、要求不很嚴(yán)，還可以進(jìn)一步簡(jiǎn)化，例如，預(yù)處理前以懸浮細(xì)胞自然沉降代替離心洗滌后收集細(xì)胞沉淀；免去高滲預(yù)處理，直接加入冰凍保護(hù)劑后在低溫下鍛煉6h；室溫下解凍等。 5、農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與制備 對(duì)本文擬使用的pBIB/GUS、pBIB/SARs、pBINm-gfp5-ER等幾種質(zhì)粒載體構(gòu)建和工程菌制備及其生長(zhǎng)特性等進(jìn)行了系列試驗(yàn)。通過(guò)酶切和PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，證明所構(gòu)建的pBIB/GUS、pBIB/SARs載體正確，含有相應(yīng)的標(biāo)志基因

11、，可以用于后續(xù)的擬南芥懸浮細(xì)胞基因轉(zhuǎn)化。采用電轉(zhuǎn)化法，成功地將pBINm-gfp5-ER質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)化頻率為2.152×104個(gè)/μg質(zhì)粒，并在一系列檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中得到證明。擬用的幾種不同質(zhì)粒具有基本相似但不完全相同的生長(zhǎng)特性，而且接種量及培養(yǎng)條件等，對(duì)其生長(zhǎng)量有很大影響。采用本文方法，成功地制備了可用于植物基因轉(zhuǎn)化的一系列工程菌株。 6、轉(zhuǎn)化模式與轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇 比較3種擬南芥懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)化方案，共培養(yǎng)后均獲得

12、GUS的瞬時(shí)表達(dá)，但僅模式Ⅲ成功地獲得抗性愈傷組織。在模式Ⅲ基礎(chǔ)上，對(duì)所獲得的抗性愈傷組織進(jìn)行二次選擇，發(fā)現(xiàn)一次選擇后的轉(zhuǎn)化細(xì)胞“假陽(yáng)性”現(xiàn)象十分普遍，推測(cè)農(nóng)桿菌潛伏與爆發(fā)、懸浮細(xì)胞存在大量細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致嵌合體形成，是轉(zhuǎn)化細(xì)胞“假陽(yáng)性”現(xiàn)象的主要原因。預(yù)處理方法、靜置共培養(yǎng)時(shí)間、恢復(fù)培養(yǎng)與液體選擇時(shí)間、載體種類等轉(zhuǎn)化條件對(duì)轉(zhuǎn)化效率有重要影響，以2μmol/L乙酰丁香酮預(yù)培養(yǎng)1d、靜置共培養(yǎng)36h、液體選擇培養(yǎng)2d、pBIB/SARs為

13、質(zhì)粒載體，可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，并大大降低假陽(yáng)性率。對(duì)以上條件進(jìn)行綜合優(yōu)化后，假陽(yáng)性率從82％降為17％。研究結(jié)果表明，在模式Ⅲ基礎(chǔ)上對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，可用于擬南芥懸浮細(xì)胞高效轉(zhuǎn)化。 7、報(bào)告基因診斷與分子檢測(cè) 對(duì)所獲得的抗性愈傷組織進(jìn)行GUS活性檢測(cè)和PCR分析。結(jié)果表明：具有GUS活性抗性愈傷組織均擴(kuò)增出目的基因片段，初步證明，所選擇的74份抗性愈傷組織已成功地轉(zhuǎn)化。對(duì)低溫、高溫、高鹽及對(duì)照4種處理后的懸浮細(xì)

14、胞進(jìn)行蛋白質(zhì)抽提，表明懸浮細(xì)胞的蛋白質(zhì)組與葉片的蛋白質(zhì)組有很大不同；分別用L-PS10H3和L-PS10AcK14H3作為第一抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫雜交，表明各處理均不同程度地發(fā)生組蛋白H3磷酸化及乙?；?，但高溫處理降低了磷酸化或乙酰化水平。 8、本文的所取得的重要進(jìn)展及主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn) 1)系統(tǒng)研究了擬南芥懸浮細(xì)胞及其愈傷組織有關(guān)生物學(xué)特性、對(duì)抗生素的反應(yīng)和對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性，不僅積累了這一重要模式植物的細(xì)胞生物學(xué)資料，同時(shí)使其

15、遺傳轉(zhuǎn)化方案和條件的制定建立在細(xì)胞生物學(xué)依據(jù)之上，為實(shí)現(xiàn)擬南芥懸浮細(xì)胞高效轉(zhuǎn)化提供了新的途徑，也為類似轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立提供了新的思路。 2)摸索了擬南芥懸浮細(xì)胞維持培養(yǎng)的繼代條件，提出“繼代指數(shù)”概念，同時(shí)建立了擬南芥懸浮細(xì)胞理論生長(zhǎng)模型，為受體材料的制備提供了科學(xué)依據(jù)。 3)摸索了擬南芥懸浮細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下和不同生長(zhǎng)階段對(duì)抗生素的反應(yīng)，使抗生素抗性標(biāo)記選擇方案更加科學(xué)，改善了抗生素選擇效果。 4)檢測(cè)或轉(zhuǎn)化了

16、多種質(zhì)粒載體系統(tǒng)，建立了不同質(zhì)粒載體農(nóng)桿菌的理論生長(zhǎng)模型，比較了不同質(zhì)粒載體農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)特性，制備了可用于植物基因轉(zhuǎn)化的一系列工程菌株。 5)改進(jìn)和優(yōu)化了擬南芥懸浮細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化方案及條件，證明所建立的優(yōu)化模式能夠大幅度提高基因轉(zhuǎn)化效率，促進(jìn)了擬南芥懸浮細(xì)胞高效轉(zhuǎn)化目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。 6)發(fā)現(xiàn)并證明了頭孢霉素能顯著地促進(jìn)擬南芥綠色懸浮細(xì)胞的獲得，成功解決了懸浮細(xì)胞“白化”的技術(shù)難題，并且有可能發(fā)掘這一抗生素新的利用途徑。