轉(zhuǎn)鹽芥CBF1基因提高玉米抗逆性的研究.pdf

1、非生物脅迫如干旱、鹽堿和低溫是限制作物產(chǎn)量和品質(zhì)的最重要因素，培育對(duì)非生物逆境抗性強(qiáng)的作物新品種對(duì)于提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力和節(jié)約資源具有重要的意義，是滿足人類對(duì)食物、能源等日益增長(zhǎng)的社會(huì)需求的重要措施。轉(zhuǎn)基因育種是提高作物抗逆性的一條有效途徑。一些轉(zhuǎn)錄因子在植物對(duì)逆境的反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，往往一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控著多個(gè)與抗逆相關(guān)的基因表達(dá)。在作物抗逆育種中導(dǎo)入或改良一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可望有效改變作物的抗逆性。 近十余年來(lái)，相繼從高等植物中分

2、離出一系列調(diào)控干旱、高鹽、低溫、激素、病原反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因，并對(duì)它們的功能進(jìn)行了較系統(tǒng)研究。DREB轉(zhuǎn)錄因子能特異識(shí)別并結(jié)合DRE/CRT順式作用元件(核心序列TACCGA CAT)，后者普遍存在于對(duì)干旱、高鹽或低溫等逆境應(yīng)答基因的啟動(dòng)子中。因此，DREB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控與逆境應(yīng)答相關(guān)的一系列基因表達(dá)，它們?cè)谵D(zhuǎn)基因植物中的過表達(dá)會(huì)激活許多與抗逆相關(guān)基因的協(xié)同表達(dá)，提高植株的抗逆性。CBFl是DREB中研究較多的成員，轉(zhuǎn)擬南芥

3、CBFl基因可明顯提高植株的抗逆性，但往往帶來(lái)植株生長(zhǎng)變慢等負(fù)效應(yīng)。自鹽生植物的CBFl基因在轉(zhuǎn)基因植物的表達(dá)及對(duì)植株抗逆性的影響未見報(bào)道，將鹽生植物小鹽芥(Thellungjella salsuginea)的TsCBFl基因?qū)胗衩字仓瓴⒎治鲛D(zhuǎn)基因植株抗逆性和生長(zhǎng)發(fā)育的變化對(duì)于玉米抗逆育種研究有較大的意義。 本工作以轉(zhuǎn)入小鹽芥TsCBFl基因的玉米植株為材料，通過PCR檢測(cè)和Sotlthern雜交鑒定轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果表明TsC

4、BFl基因成功地整合到轉(zhuǎn)基因玉米的基因組中；采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析轉(zhuǎn)基因植株中TsCBFl和玉米ZmDREB基因表達(dá)強(qiáng)度，以植株內(nèi)源actin基因的表達(dá)強(qiáng)度為參照，確定了目標(biāo)基因表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果表明，TsCBFl在轉(zhuǎn)基因植株中較高強(qiáng)度的表達(dá)；而ZmDREB在轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)基因植株中均表達(dá)，但在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)強(qiáng)度低于未轉(zhuǎn)基因植株的。若從TsCBFl mRNA和ZmDREB mRNA的總量角度去考慮，轉(zhuǎn)基因植株具有顯著增加的DREB

5、/CBFlmRNA拷貝數(shù)。 在轉(zhuǎn)基因植株T<,2>代株系中選取5個(gè)轉(zhuǎn)基因純合且農(nóng)藝性狀與轉(zhuǎn)基因受體自交系DH4866無(wú)明顯差異的株系進(jìn)行耐旱耐鹽性試驗(yàn)。種子播在大小一致的花盆中，在植株10葉期時(shí)開始干旱脅迫處理，每天控制澆水量，使其土壤相對(duì)含水量保持在15-16﹪左右，持續(xù)處理2周，然后恢復(fù)正常澆水。在正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)特征無(wú)顯著差異。經(jīng)干旱脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株在株高、雄穗分支數(shù)、開

6、花散粉時(shí)間、散粉-吐絲間隔時(shí)間、花粉活力、果穗長(zhǎng)度、百粒重等性狀均出現(xiàn)明顯差異。未轉(zhuǎn)基因植株雄穗分支數(shù)少、雄蕊發(fā)育不良、花粉敗育、散粉-吐絲間隔時(shí)間、單株籽粒產(chǎn)量低，而轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出明顯提高的耐旱性，花粉發(fā)育正常，單株籽粒產(chǎn)量明顯高于對(duì)照的。即轉(zhuǎn)基因植株在干旱處理過程中生長(zhǎng)發(fā)育較正常，具有明顯增強(qiáng)的耐旱性。 將控制澆水第2天(葉片在上午9時(shí)左右開始萎蔫)記為植株干旱脅迫處理第0天，分別在處理的第0、1、5、10、14天和恢復(fù)正

7、常澆水后的第7天取材，測(cè)定葉片相對(duì)含水量，可溶性總糖含量，離子滲漏率，丙二醛含量，脯氨酸含量等生理指標(biāo)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株葉片相對(duì)含水量比對(duì)照植株降低的慢，保水能力較強(qiáng)；離子滲漏率和丙二醛含量表明轉(zhuǎn)基因植株葉片細(xì)胞膜損傷較小，可溶性糖及脯氨酸含量明顯高于對(duì)照植株的，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫下可能是通過積累較多的滲透保護(hù)性物質(zhì)來(lái)維持正常代謝。 對(duì)苗期玉米澆灌0.5﹪的鹽水，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性明顯高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?。測(cè)定苗期植株在

8、鹽處理?xiàng)l件下地上部分及地下部分鮮重、干重等發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)發(fā)育正常，未出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩、植株矮化等情況。推測(cè)可能轉(zhuǎn)入的TsCBF1基因未激活下游與植株生長(zhǎng)發(fā)育遲緩有關(guān)基因的表達(dá)。 綜上所述，TsCBF1基因具有DREB轉(zhuǎn)錄因子家族成員的功能，在轉(zhuǎn)基因玉米中表達(dá)提高了植株的耐旱性和耐鹽性。表達(dá)TsCBF1基因的玉米植株不但表現(xiàn)出比對(duì)照植株明顯提高的耐旱耐鹽性，而且在正常生長(zhǎng)環(huán)境中植株生長(zhǎng)發(fā)育正常，不出現(xiàn)矮化現(xiàn)象。通過本工作，篩選出