農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CBF1基因轉(zhuǎn)化唐菖蒲的研究.pdf

1、唐菖蒲（Gladiolus hybridus Hort.）是鳶尾科唐菖蒲屬多年生球根花卉，是享譽(yù)世界的四大切花之一，在各國鮮切花生產(chǎn)及消費(fèi)中處于舉足輕重的地位。唐菖蒲雖然生長健壯，但耐寒力較差，易受霜害，生長臨界低溫僅為3℃，低溫成為限制唐菖蒲分布和生產(chǎn)的因子。
　　 現(xiàn)代唐菖蒲品種大多為夏花型品種，在冬季氣溫較低的地區(qū)，露地栽培僅在春夏季節(jié)，其栽培范圍受到了很大的限制，同時(shí)由于病寒冷導(dǎo)致植株生長發(fā)育不良，降低種球和切花的品質(zhì)，

2、大大影響了唐菖蒲的觀賞品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)品質(zhì)，因此需要培育出抗寒品種。轉(zhuǎn)錄激活因子CBF1能夠誘導(dǎo)低溫調(diào)節(jié)蛋白（COR蛋白）的表達(dá)，使未經(jīng)過低溫馴化的植株具備一定的抗凍力，因此通過轉(zhuǎn)化CBF1基因，可以提高唐菖蒲的抗寒性，成為提高唐菖蒲產(chǎn)量和改善品質(zhì)的有效途徑。
　　 本文以唐菖蒲品種‘金色原野’（God Field）為試材，以球莖芽為外植體，研究了愈傷組織經(jīng)體細(xì)胞胚再生的過程，建立了高頻的體細(xì)胞胚再生體系；并在此基礎(chǔ)上以唐菖蒲體細(xì)胞胚

3、為遺傳轉(zhuǎn)化受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將轉(zhuǎn)錄激活因子CBF1轉(zhuǎn)入唐菖蒲，建立了穩(wěn)定的遺傳再生體系，經(jīng)PCR檢測獲得陽性植株，為培育擁有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的抗寒耐逆品種提供理論和試驗(yàn)依據(jù)，研究結(jié)果如下：
　　 1．唐菖蒲體細(xì)胞胚再生體系的建立：以球莖芽切片為外植體，胚性愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+2,4-D4mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L，確定最佳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2,4-D0.5mg/L+T

4、DZ0.3mg/L+蔗糖30g/L+甘露醇30g/L+瓊脂7.5g/L；將產(chǎn)生的體細(xì)胞胚首先接種于MS+蔗糖30g/L+甘露醇30g/L+瓊脂7.5g/L中使其充分發(fā)育，隨后轉(zhuǎn)入MS+6-BA1.0mg/L+蔗糖30g/L+甘露醇30g/L+瓊脂7.5g/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)萌發(fā)，再轉(zhuǎn)入MS+IBA1.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，最后馴化移栽使其形成完整植株。
　　 2．唐菖蒲體細(xì)胞胚遺傳轉(zhuǎn)化體系的建

5、立：以體細(xì)胞胚為遺傳轉(zhuǎn)化受體，確定體細(xì)胞胚萌發(fā)階段的草甘磷（PPT）選擇壓力為1.4mg/L，頭孢霉素（Cef）的除菌濃度為350mg/L，最佳的遺傳轉(zhuǎn)化體系為：預(yù)培養(yǎng)4d+侵染菌液OD600值0.5+侵染25min+共培養(yǎng)3d（阿魏酸150mg/L）+延遲篩選2周。
　　 3．轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測：經(jīng)體細(xì)胞胚再生途徑共得到26株抗性植株，以唐菖蒲總DNA為模版，CBF1基因兩端序列合成引物，對抗性植株進(jìn)行PCR檢測有3株呈陽性