gpd1基因的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化萊茵衣藻.pdf

1、目前臨近枯竭的傳統(tǒng)化石燃料及日益惡化的環(huán)境問(wèn)題，致使生物能源越來(lái)越得到廣泛關(guān)注，其中藻類生物能源也受到各國(guó)科學(xué)家的重視。微藻含油量高、生物量高、材料易培養(yǎng)和采收、不占用耕作用地等，可以利用現(xiàn)代生物技術(shù)強(qiáng)化微藻脂質(zhì)代謝途徑、增加微藻的含油量來(lái)提高微藻產(chǎn)油的競(jìng)爭(zhēng)力。其中萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是遺傳背景清晰的真核單細(xì)胞藻類，是應(yīng)用于微藻研究中有關(guān)生物燃料研究領(lǐng)域的模式藻，更是研究油脂代謝基因的理想受體藻

2、。
　　甘油-3-磷酸脫氫酶基因（gpd1）可以調(diào)控植物脂質(zhì)代謝中關(guān)鍵酶甘油-3-磷酸脫氫酶(GPDH)的活性，能促進(jìn)植物脂質(zhì)合成，同樣也決定萊茵衣藻代謝中甘油三酯(TAG)的合成。借助外源gpd1基因提高萊茵衣藻TAG含量，有助于完善萊茵衣藻TAG調(diào)控的相關(guān)通路和其脂質(zhì)積累條件的摸索。研究表明在細(xì)胞壁缺陷型微藻中過(guò)表達(dá)外源gpd1基因可以提高藻細(xì)胞的油脂含量，但是所選的細(xì)胞壁缺陷型藻株材料造成了gpd1基因的過(guò)表達(dá)研究的局限性。

3、
　　基于此，本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在常規(guī)萊茵衣藻（有細(xì)胞壁）中過(guò)表達(dá)gpd1基因，來(lái)提高藻細(xì)胞油脂含量。實(shí)驗(yàn)中克隆酵母gpd1基因，構(gòu)建萊茵衣藻的農(nóng)桿菌雙元表達(dá)載體pRI-Ble-GPD1，以萊茵衣藻（藻株:FACHB-479）為受體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將gpd1基因轉(zhuǎn)移到FACHB-479基因組，經(jīng)過(guò)篩選培養(yǎng)、PCR及RT-PCR分子生物學(xué)鑒定獲得轉(zhuǎn)基因藻株，其中油脂含量可以增高。所取得的具體研究結(jié)果如下:
　　1.優(yōu)化了

4、萊茵衣藻FACHB-479實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)體系:TAP培養(yǎng)基，2000Lx、25±2℃，每天數(shù)次100rpm震蕩5min，培養(yǎng)5d可以達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且不凝集;進(jìn)行1∶1000傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。
　　2.本研究構(gòu)建了適用于應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化萊茵衣藻FACHB-479的帶有外源酵母gpd1基因的雙元表達(dá)載體pRI-Ble-GPD1:經(jīng)過(guò)酵母gpd1基因的PCR獲得，重組克隆載體pMD-GPD1的構(gòu)建，重組中間載體pDBle-

5、GPD1的構(gòu)建，表達(dá)載體pRI-Ble-GPD1的構(gòu)建四步構(gòu)建出表達(dá)載體。之后凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞，并通過(guò)Amp(100μg/mL)抗性的YEB平板篩選得到陽(yáng)性LBA4404，可以攜帶外源酵母gpd1基因，用于衣藻的轉(zhuǎn)化。
　　3.通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)化萊茵衣藻FACHB-479，獲得轉(zhuǎn)gpd1基因藻株FACHB-GPD:衣藻載體pRI-Ble-GPD1攜帶gpd1基因，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化FACHB-479

6、細(xì)胞，歷經(jīng)共培養(yǎng)48h，Zeocin(10μg/mL)抗性的TAP固體篩選培養(yǎng)5d，可以收獲到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化藻;PCR和RT-PCR檢測(cè)目標(biāo)條帶1175bp存在，目的gpd1基因在轉(zhuǎn)基因FACHB-GPD順利整合和表達(dá)。
　　4.優(yōu)化了尼羅紅染色法檢測(cè)萊茵衣藻油脂的方法:使用終濃度40mg/L的尼羅紅—甲醇溶液，23℃，避光染色15min，萊茵衣藻細(xì)胞中脂滴熒光效果好。
　　5.轉(zhuǎn)gpd1基因藻FACHB-GPD的油脂含量提高:尼