慈竹和硬頭黃竹4CL基因及其上游序列克隆與表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、本研究以四川省眉山市青神縣生慈竹和硬頭黃竹幼筍為研究材料，采用Trizol一步法提取慈竹和硬頭黃竹幼筍總RNA，進(jìn)行RT—PCR得到相應(yīng)的cDNA。以慈竹和硬頭黃竹cDNA為模板，分別進(jìn)行了慈竹4CL基因全長(zhǎng)、慈竹4CL基因上游調(diào)控序列、慈竹β—tubulin基因保守區(qū)，以及硬頭黃竹4CL基因保守區(qū)的克隆研究，并構(gòu)建了慈竹4CL基因的中間表達(dá)載體。主要結(jié)果如下。 由慈竹得到1條新的4CL基因保守區(qū)片段。以這條保守區(qū)片段為模板，結(jié)

2、合5’RACE和3'RACE得到一條新的4CL基因全長(zhǎng)序列。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該序列CDS區(qū)全長(zhǎng)為1674bp，編碼558個(gè)氨基酸；氨基酸序列中存在SSGTTGMPKGV和GEICIRG兩大4CL氨基酸保守域。該4CL基因全長(zhǎng)序列提交Genbank注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)為EU327341。同時(shí)，對(duì)這條慈竹4CL基因序列進(jìn)行中間表達(dá)載體構(gòu)建，將4CL基因和Part7載體一起構(gòu)建成慈竹4CL基因中間表達(dá)載體。 以克隆得到的慈竹4CL基因

3、全長(zhǎng)序列為參照設(shè)計(jì)引物，以SDS法提取慈竹竹心基因組DNA，利用染色體步移技術(shù)（Chromosome Walking）擴(kuò)增得到慈竹4CL基因的上游部分調(diào)控序列。該序列長(zhǎng)420bp，具有植物啟動(dòng)子的基本元件TATA—box和GC—box，以及4CL—CMA2b等調(diào)控元件。 在慈竹中還克隆得到3條新的β—tubulin基因cDNA序列。生物信息學(xué)分析表明，這3條序列長(zhǎng)度分別為958bp、958bp和959bp，分別編碼318、318

4、和319個(gè)氨基酸；氨基酸序列中包含有tubulin家族的標(biāo)志性氨基酸保守域GGGTGSG。3條β—tubulin基因cDNA序列提交Genbank注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)分別為EU246956、EU246957、EU246958。 硬頭黃竹中，克隆得到3條新的4CL基因保守區(qū)片段，長(zhǎng)度都為699，都編碼232個(gè)氨基酸。經(jīng)過NCBI網(wǎng)站Blast X程序和生物信息學(xué)分析證明為硬頭黃竹4CL基因保守區(qū)序列。 本研究第一次在慈竹和硬頭黃竹