馬尾松木質(zhì)素合成途徑中4CL基因克隆及RNA干擾載體構(gòu)建研究.pdf

1、馬尾松分布范圍廣泛，木材纖維較長(zhǎng)，因而成為主要造紙樹種之一。造紙工業(yè)最大的技術(shù)難題是木質(zhì)素的降解，這個(gè)過(guò)程不僅要消耗大量的化學(xué)藥品，更為嚴(yán)重的是產(chǎn)生大量造紙廢液，對(duì)環(huán)境造成極大的破壞。因此，培育低木質(zhì)素含量的造紙?jiān)蠘浞N，已成為破解造紙污染難題的林業(yè)生物技術(shù)前沿研究的趨勢(shì)，將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。本文以我國(guó)造紙優(yōu)勢(shì)資源樹種馬尾松為研究對(duì)象，克隆馬尾松木質(zhì)素合成調(diào)控的關(guān)鍵基因：4－香豆酸輔酶A連接酶(4-Coumarate：Coe

2、nzyme A Ligase，4CL)，構(gòu)建馬尾松4CL基因的RNA干擾載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)入模式植物煙草，為低木質(zhì)素馬尾松轉(zhuǎn)基因育種提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。
　　 獲得了以下主要結(jié)果：
　　 (1)馬尾松4CL基因的全長(zhǎng)克隆。以馬尾松葉片和次生木質(zhì)部為材料，分別提取基因組DNA和總RNA，并分別以總DNA和以總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，根據(jù)4CL基因的保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)多對(duì)引物，通過(guò)同源PCR克隆及R

3、T-PCR技術(shù)擴(kuò)增出4CL基因的DNA片段和cDNA片段，并將產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株。經(jīng)雙向DNA測(cè)序及Blast分析，證實(shí)已獲得2696bp的4CL全長(zhǎng)基因組DNA克隆和1642bp的全長(zhǎng)cDNA克隆，并將結(jié)果提交至Genebank中。
　　 (2)馬尾松4CL基因的生物信息學(xué)分析。通過(guò)生物信息學(xué)軟件Vector NTI10.0和NCBI在線軟件對(duì)馬尾松4CL基因進(jìn)行分析。結(jié)果表明，馬尾松4CL

4、全長(zhǎng)基因組DNA為2696bp，含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子；全長(zhǎng)cDNA為1642 bp，含有一個(gè)1440 bp的可讀編碼框。應(yīng)用蛋白質(zhì)分析軟件對(duì)4CL推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析。結(jié)果顯示4CL蛋白由480個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為51.975KDa，等電點(diǎn)為5.84，存在2個(gè)跨膜區(qū)域，為疏水性蛋白，定位于線粒體膜上，有信號(hào)肽，屬于分泌型蛋白。
　　 (3)馬尾松4CL基因的原核表達(dá)研究。以馬尾松4CL全長(zhǎng)c

5、DNA為模板，設(shè)計(jì)特異表達(dá)引物，通過(guò)雙內(nèi)切酶BamHI-Xhol方法，插入至表達(dá)載體pET-32a中，構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒pET32a-4CL，并成功在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá)。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果表明，馬尾松4CL蛋白在誘導(dǎo)4h時(shí)，表達(dá)量最大。
　　 (4)馬尾松4CL基因的RNA干擾載體構(gòu)建。以克隆的馬尾松4CL全長(zhǎng)cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)高保真擴(kuò)增技術(shù)獲得了馬尾松4CL的正義、反義基因干擾片段，大小分別為

6、390bp和390bp；以pRi35S作為橋梁載體，成功構(gòu)建馬尾松4CL基因的RNA干擾載體：pRi35S-4CLzf。
　　 (5)馬尾松RNA干擾載體pRi35S-4CLzf的遺傳轉(zhuǎn)化研究。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化技術(shù)，將載體pRi35S-4CLzf導(dǎo)入模式植物煙草并獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)經(jīng)過(guò)抗性篩選和PCR驗(yàn)證后的轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)表型觀察表明，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因煙草植株沒(méi)有出現(xiàn)矮化、倒伏等不良現(xiàn)象。利用KIaso