板栗花芽分化相關(guān)基因克隆與RNA干擾載體構(gòu)建.pdf

1、板栗(Castanea mollissima)是世界上分布廣泛、經(jīng)濟(jì)栽培價(jià)值高的一種園藝作物。板栗為山毛櫸科栗屬植物，屬于落葉喬木，源自中國，是一種比較古老的果樹。板栗為葇荑花序、雌雄同株的植物。由于板栗雌雄花器官發(fā)育不同步，且雄花數(shù)量遠(yuǎn)高于雌花，過多的雄花消耗了大量營養(yǎng)，直接導(dǎo)致板栗產(chǎn)量減少。對(duì)其生長及開花過程的研究，已經(jīng)從形態(tài)學(xué)上掌握了雌雄花芽發(fā)育的規(guī)律，但是對(duì)影響板栗開花的相關(guān)基因調(diào)控機(jī)理的分子水平研究還有待深化。FLC作為調(diào)控有

2、花植物開花時(shí)間的關(guān)鍵基因，在春化作用途徑中抑制下游開花基因的表達(dá)，從而在植物開花控制方面起決定作用。本實(shí)驗(yàn)以羅田板栗主栽品種玫瑰紅為研究材料，通過反轉(zhuǎn)錄及 RACE技術(shù)對(duì)板栗花芽分化相關(guān)基因FLC和MADS的cDNA進(jìn)行克隆，獲得這兩個(gè)基因的cDNA全長序列，基于其序列的生物信息學(xué)分析結(jié)果，構(gòu)建了FLC RNA干擾的植物表達(dá)載體，為后續(xù)研究該基因的表達(dá)分析奠定基礎(chǔ)。本文研究的內(nèi)容及結(jié)果主要有以下兩方面：
　　(1)板栗FLC基因的

3、cDNA全長序列分離及分析。在設(shè)計(jì)特異性引物的基礎(chǔ)上，利用RACE技術(shù)，從板栗葉片總RNA中分離了CmFLC cDNA的全長序列，該序列全長為968bp，其中有一個(gè)編碼含227個(gè)氨基酸蛋白序列的開放閱讀框。通過生物信息學(xué)預(yù)測，CmFLC蛋白的理論等電點(diǎn)為5.80，分子質(zhì)量為25.62kDa，N端含有M盒保守序列，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)大部分由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成。蛋白質(zhì)的同源分析結(jié)果顯示，CmFLC存在兩個(gè)特征性序列區(qū)域，分別是M盒、K盒

4、。建立模型進(jìn)行同源分析，結(jié)果顯示CmFLC蛋白與毛白楊FLC蛋白的三維結(jié)構(gòu)存在高度相似性。通過系統(tǒng)進(jìn)化分析，證實(shí)板栗的FLC蛋白屬于植物進(jìn)化分支，并且與山核桃的FLC蛋白同屬一支。
　　(2)板栗MADS基因的cDNA全長序列分離、分析及CmFLC基因RNA干擾載體構(gòu)建。通過RNA反轉(zhuǎn)錄及RACE技術(shù)從板栗葉片和花的總RNA中分離到全長為922bp的CmMADS的cDNA序列，該序列有一個(gè)編碼含227個(gè)氨基酸蛋白序列的長度為681

5、bp的開放閱讀框。通過生物信息學(xué)預(yù)測，CmMADS蛋白的理論等電點(diǎn)為6.27，分子質(zhì)量為25.87kDa，其N端含有M盒保守序列，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成。將蛋白質(zhì)進(jìn)行同源分析顯示，CmMADS存在兩個(gè)特征性序列區(qū)域，分別為M盒、K盒。蛋白質(zhì)同源建模分析結(jié)果表明CmMADS蛋白序列同蘋果MADS蛋白的三維結(jié)構(gòu)具有較高的相似度。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，板栗的MADS蛋白屬于植物進(jìn)化分支，并且與太行花的MADS蛋白同屬一支。將

6、CmFLC基因兩段長度同為283bp的反向互補(bǔ)片段Fflc和Rflc連入載體pBluescript SK plus，構(gòu)成中間載體pBluescript SK plus-FR。用Kpn I和BanH I同時(shí)酶切植物表達(dá)載體pcl301-ubi及中間載體pBluescript SK plus-FR，回收pBluescript SK plus-FR的酶切片段，連入到pcl301-ubi片段中，植物表達(dá)載體pcl301-ubi-CmFLC-ds