油用牡丹‘鳳丹’DFR基因克隆與功能驗(yàn)證及木質(zhì)素合成基因發(fā)掘.pdf

1、‘鳳丹’牡丹是芍藥科芍藥屬多年生灌木，是中國(guó)傳統(tǒng)的觀賞植物及藥用植物。近年來(lái)，由其種子出油率高、油質(zhì)優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)，而被選作主要的油用牡丹栽培品種?！P丹’籽油品質(zhì)優(yōu)良，具有很高的推廣價(jià)值及發(fā)展?jié)摿?。但在生產(chǎn)過(guò)程中，直接用種子榨油則會(huì)出現(xiàn)黑色異物，因此在實(shí)際過(guò)程中需要去除種子外表堅(jiān)硬的黑色種殼，對(duì)出油產(chǎn)量造成了一定程度的影響。色素分析表明，在油用牡丹中，控制種皮顏色的主要成分是類黃酮類物質(zhì)，而種皮的主要成分則是木質(zhì)素。因此，克隆并分析相關(guān)基

2、因不僅有助于了解種殼黑色物質(zhì)及木質(zhì)素合成的相關(guān)機(jī)制，而且可以為下一步通過(guò)調(diào)解基因工程手段在根本上解決牡丹種殼的黑色及減少其中的木質(zhì)素含量提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)中以‘鳳丹’牡丹種子為材料，進(jìn)行了類黃酮合成重要基因DFR的克隆及功能驗(yàn)證。結(jié)果表明:‘鳳丹’二氫黃酮醇4-還原酶基因（dihydroflavonol4-reductase，DFR）本基因含有一個(gè)長(zhǎng)度為1092 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，共編碼364個(gè)氨基酸。其中

3、，‘鳳丹’的DFR蛋白的相對(duì)分子量為40796.17 Da，理論等電點(diǎn)(PI)是5.76。亞細(xì)胞定位為細(xì)胞質(zhì)的可能性最大;使用實(shí)時(shí)熒光定量法對(duì)PoDFR基因在‘鳳丹’牡丹種子4個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示:PoDFR基因在‘鳳丹’種子發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量先上升又下降，在S2時(shí)期表達(dá)量達(dá)到最高;構(gòu)建了原核表達(dá)載體，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，獲得PoDFR原核表達(dá)蛋白，通過(guò)與反應(yīng)底物二氫槲皮素反應(yīng)，證明了PoDFR蛋白能夠催化合成無(wú)色花青素類

4、物質(zhì)，并且與ANS蛋白結(jié)合反應(yīng)能合成花青素類物質(zhì)，進(jìn)一步證明了該基因的功能。
　　分別以‘鳳丹’牡丹種子種殼與種仁為材料，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了110，151條基因序列，平均長(zhǎng)度達(dá)到了1010 bp，基因功能注釋率為50.44％。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平比較，共得到了19，530條差異表達(dá)基因，從中篩選出8個(gè)木質(zhì)素合成途徑相關(guān)基因，其中包括咖啡酸/5-羥基阿魏酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)、咖啡酰輔酶-A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT