雞TLR4不同突變基因型對抗腸炎沙門氏菌感染的差異.pdf

1、腸炎沙門氏菌可以感染雛雞并引發(fā)死亡,是造成食品安全隱患的人畜共患病菌。腸炎沙門氏菌的模式抗原LPS在LBP、CD14、MD-2蛋白分子輔助下激活TLR4-MyD88跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,誘導(dǎo)促炎基因的表達(dá),介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)并產(chǎn)生抗菌作用。為闡明雞TLR4-MyD88跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的機(jī)制以及篩選具有抗菌作用的突變位點(diǎn),本研究開展以下試驗(yàn):
　　 試驗(yàn)一:采用同源模建的方法獲得雞TLR4蛋白胞外段和MD-2蛋白的三維結(jié)構(gòu),以小鼠和人T

2、LR4-MD-2異質(zhì)二聚體空間結(jié)構(gòu)為模板,對已獲得蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行ZDOCK對接,并分析TLR4胞外段(Asp301Glu,Arg611Gln)氨基酸突變對蛋白結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明,雞、小鼠和人TLR4-MD-2異質(zhì)二聚體的互作氨基酸高度保守,互作機(jī)制存在一致性。301和611兩個(gè)位點(diǎn)氨基酸突變引起TLR4蛋白分子內(nèi)氫鍵數(shù)量減少和突變位點(diǎn)周圍蛋白二級結(jié)構(gòu)改變,突變后蛋白空間構(gòu)象穩(wěn)定性變差。
　　 試驗(yàn):從雞脾臟cDNA中擴(kuò)增87

3、5bp MyD88基因片段,克隆入pMAL-c5X表達(dá)載體,成功構(gòu)建融合表達(dá)載體pMAL-MyD88,轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3),用0.2mM的IPTG進(jìn)行30℃誘導(dǎo)6h,SDS-PAGE電泳檢測,MBP-MyD88融合蛋白條帶在76KD附近,可溶性蛋白比例達(dá)到75％。將純化蛋白與免疫佐劑混合免疫Balb／c小鼠,取脾臟細(xì)胞與SP2／0細(xì)胞用PEG4000融合,經(jīng)過間接ELISA,3次亞克隆和Western Blot特異性檢測排除針對

4、MBP蛋白的雜交瘤,獲得三株可以穩(wěn)定分泌針對MyDS8天然蛋白單抗的細(xì)胞株,命名為1F7、4G8和5E7,抗體亞型分別為IgG1、IgG1、IgG2a,輕鏈均為κ,抗體效價(jià)均為1:2×105。
　　 試驗(yàn)三:在分析301和611突變位點(diǎn)對蛋白空間結(jié)構(gòu)影響的基礎(chǔ)上,以SPF雞為素材,對該兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行DNA檢測和基因分型,并選取Ⅰ(903TT1832GG),Ⅱ(903TG1832AA),Ⅲ(903GG1832AA),Ⅳ(903TG1

5、832AG)四種基因型于21日齡進(jìn)行腸炎沙門氏菌胸肌注射,攻菌劑量為0.5mL×108CFU／只,攻菌后1-5DPI分別進(jìn)行組織載菌量測定,并用Western Blot進(jìn)行MyD88相對定量。結(jié)果顯示,四種基因型在2DPI和3DPI的盲腸、脾臟和法氏囊載菌量均呈現(xiàn)顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)組間差異;不同基因型之間的MyD88蛋白相對表達(dá)量,在盲腸(1DPI、P<0.01,2DPI、P<0.05)、脾臟(3DPI,P<0