芥菜型油菜胞質(zhì)不育Hau CMS不育相關(guān)基因的鑒定及其功能分析.pdf

1、細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)是油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑。目前，國內(nèi)外主要應(yīng)用的油菜CMS系統(tǒng)有ogura CMS和polima CMS，其中ogura系統(tǒng)在歐洲應(yīng)用較多，國內(nèi)主要使用傅廷棟教授于1972年發(fā)現(xiàn)的polima胞質(zhì)不育系統(tǒng)。然而，生產(chǎn)上雜交種的胞質(zhì)單一化存在著潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，鑒定新的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型及其胞質(zhì)不育基因?qū)τ趯?shí)現(xiàn)雜交種胞質(zhì)來源多樣化具有重要意義。本研究以hau CMS原始芥菜型油菜和轉(zhuǎn)育的甘藍(lán)型油菜保持系和不育系為

2、實(shí)驗(yàn)材料，通過對(duì)hau胞質(zhì)線粒體基因及側(cè)翼特異區(qū)域進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)及其表達(dá)，翻譯分析；并進(jìn)一步通過原核表達(dá)及植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法，對(duì)hau胞質(zhì)特異的異常開放讀碼框進(jìn)行功能分析，鑒定hau胞質(zhì)的不育相關(guān)基因。本研究的主要結(jié)果如下：
　　 1.hau胞質(zhì)線粒體基因組特異區(qū)段的分析
　　 通過對(duì)不育系線粒體的功能基因側(cè)翼序列進(jìn)行染色體步移(genome walking)及序列對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)hau CMS線粒體atp6基因的下游與其芥

3、菜型油菜保持系，甘藍(lán)型油菜保持系存在明顯差異。進(jìn)一步對(duì)該區(qū)域進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域可能包含一異常開放讀碼框(chimeric open reading frame)-orf288，與已報(bào)道的tour胞質(zhì)的同源區(qū)域相似度較高(99.5%)。在所比較的序列內(nèi)有四個(gè)位點(diǎn)的差異，hauCMS相對(duì)于tour胞質(zhì)有三個(gè)堿基(485 bp，785 bp，802 bp)的置換和一個(gè)堿基(764bp)的缺失，該開放閱讀框與甘藍(lán)型油菜油菜nap胞質(zhì)

4、線粒體orf286同源性為93%。
　　 2.hau胞質(zhì)不育相關(guān)區(qū)域atp6/orf288的表達(dá)分析
　　 通過RT-PCR和northern雜交分析，證實(shí)了atp6和orf288在不育系線粒體中共轉(zhuǎn)錄；對(duì)orf288編碼的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，推測其編碼的蛋白N端包含3個(gè)跨膜區(qū)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證orf288在不育系中可以翻譯成蛋白，我們合成了ORF288部分氨基酸序列用于制備其特異的多克隆抗體。通過特異的多克隆抗體對(duì)

5、不育系線粒體蛋白和花蕾總蛋白進(jìn)行western雜交，結(jié)果表明orf88在hau CMS不育系中翻譯成大小約32 kD的蛋白。
　　 3.ORF288對(duì)大腸桿菌宿主菌具有毒害作用
　　 細(xì)胞質(zhì)不育基因通過影響線粒體物質(zhì)和能量代謝而導(dǎo)致植物雄性器官發(fā)育異常，而線粒體起源于共生在真核細(xì)胞中的細(xì)菌。因此，一些研究表明不育基因在大腸桿菌中表達(dá)，會(huì)抑制大腸桿菌的生長或?qū)ζ渚哂兄滤雷饔?。我們將orf288連入原核表達(dá)載體PET32a，

6、在IPTG誘導(dǎo)下在BL21(DE3)菌株中表達(dá)。結(jié)果表明ORF288對(duì)大腸桿菌宿主細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。這一結(jié)果說明orf288對(duì)大腸桿菌具有毒害作用，可能以同樣的方式作用于植物線粒體，并進(jìn)一步影響雄蕊發(fā)育。
　　 4.orf288的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化植株雄蕊敗育
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證orf288的功能，我們構(gòu)建了4個(gè)植物轉(zhuǎn)化載體：(1)VNO：包含35S啟動(dòng)子，酵母Y187菌株coxⅣ基因的線粒體定位信號(hào)和orf2

7、88編碼序列；(2)VN3：包含擬南芥AP3基因啟動(dòng)子，酵母Y187菌株coxⅣ基因的線粒體定位信號(hào)和orf288編碼序列；(3)VNⅡ：包含擬南芥AP3啟動(dòng)子序列和orf288開放閱讀框；(4)AGUS：AP3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因的載體。擬南芥轉(zhuǎn)基因結(jié)果表明，VN3和VNⅡ載體80%的轉(zhuǎn)化植株表現(xiàn)為雄蕊敗育，而VNO載體和AGUS對(duì)照載體轉(zhuǎn)化植株的育性并沒有變化。
　　 5.ORF288的亞細(xì)胞定位
　　 擬南芥轉(zhuǎn)化

8、實(shí)驗(yàn)表明，orf288在轉(zhuǎn)化植株中表達(dá)能夠?qū)е轮参镉缘淖兓?。其中VNⅡ載體轉(zhuǎn)化植株表型與VN3一致。因此，我們推測orf288在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中可以行使其功能或其自身可以定位到線粒體(在線粒體外表達(dá))。通過PredSL和TargetP對(duì)ORF288氨基酸進(jìn)行軟件預(yù)測分析，其N端可能包含一段線粒體定位信號(hào)。為了進(jìn)一步闡明orf288具有自身的線粒體定位信號(hào)，我們將其融合在GFP的N端，通過PEG介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，擬南芥原生質(zhì)體瞬