大白菜胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因的克隆及差異表達(dá)研究.pdf

1、細(xì)胞質(zhì)雄性不育是大白菜生產(chǎn)一代雜種的理想系統(tǒng)。西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院(原陜西省蔬菜花卉研究所)自20世紀(jì)70年代開展大白菜雄性不育研究，先后育成了CMS3411-7和CMS7311等不同來源、不同性狀的大白菜異源胞質(zhì)雄性不育系，并應(yīng)用于雜交一代大白菜制種。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，以兩套雄性不育材料為研究對象，應(yīng)用分子生物學(xué)方法，分離并克隆與CMS相關(guān)的基因，并對不育相關(guān)基因的差異表達(dá)進(jìn)行了分析。主要結(jié)果如下： 1.建立了一種

2、適用于大白菜線粒體DNA(mtDNA)的提取方法。該方法以大白菜球葉為材料，采用差速離心和蔗糖襯墊相結(jié)合的方法分離出線粒體，然后用SDS—蛋白酶K裂解法提取mtDNA。該方法試材充足、成本低、且省時，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求簡單，分離出的mtDNA質(zhì)量較高，能滿足分子生物學(xué)研究需要。 2.建立了一種有效、快捷的大白菜花蕾總RNA提取方法。以酸性酚—硫氰酸胍—氯仿提取法為基礎(chǔ)，減少第二次提取液抽提的過程，增加一次高速離心的過程，提取大白菜花

3、蕾總RNA。該方法與其他方法相比，步驟簡單、成功率高，分離出的RNA成功的應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)錄和cDNA-RAPD實(shí)驗(yàn)。 3.從胞質(zhì)雄性不育材料CMS7311的線粒體基因組中擴(kuò)增出與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的片斷CMS7311-orf224，并克隆測序。序列分析表明：該片斷和報(bào)道的Polima-orf224序列完全相同，說明CMS7311的不育機(jī)理與PolimaCMS相似，也反映了細(xì)胞質(zhì)雄性不育變異的保守性。 4.通過改良的RNA指紋

4、技術(shù)獲得了兩個可能與大白菜胞質(zhì)雄性不育高度相關(guān)的差異表達(dá)片斷S176-343及S199-904，對其克隆、測序、同源性分析表明：兩差異片斷均和油菜Polima不育胞質(zhì)線粒體基因組orf224/atp6位點(diǎn)有著極高的同源性，兩差異片斷分別位于orf224/atp6座位的不同位點(diǎn)上，其序列部分重疊；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，S176-343片斷僅在轉(zhuǎn)錄水平存在差異，在線粒體基因組水平不育系和保持系沒有差異，S199-904片斷在線粒體基因組水平和轉(zhuǎn)錄