水稻和紅麻雄性不育相關(guān)基因MS5的克隆、表達(dá)及轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、MS5(male sterile5)基因又名POLLENLESS3基因或TDM1基因。MS5最早在擬南芥發(fā)現(xiàn)，且是一個育性相關(guān)的基因，MS5突變會導(dǎo)致雄性不育。相關(guān)研究顯示，它在調(diào)控細(xì)胞周期活動及在發(fā)育的花藥細(xì)胞的減數(shù)分裂過程中起著關(guān)鍵作用。MS5突變體由于在第二次減數(shù)分裂后出現(xiàn)了一次額外的分裂，而染色體沒有復(fù)制，結(jié)果導(dǎo)致染色體異常，出現(xiàn)多分體。其編碼的蛋白產(chǎn)物類似小鼠聯(lián)會復(fù)合體蛋白SCP1，遺傳分析顯示它是一個細(xì)胞核隱性孢子突變體(C

2、haudhury et al.，1994)。MS5基因?qū)儆谝粋€植物界中高度保守的小的多基因家族的成員。
　　 李剛(2009)采用同重標(biāo)簽相對與絕對定量(iTRAQ)標(biāo)記分析了紅麻不育系L23A和保持系L23B單核期花藥線粒體的蛋白質(zhì)組差異，共鑒定出93個顯著差異的蛋白質(zhì)。在所鑒定的差異蛋白中，將No.326蛋白與水稻蛋白質(zhì)數(shù)庫進(jìn)行比對，鑒定出No.326蛋白與POLLENLESS3基因高度同源，POLLENLESS3，又名MS

3、5基因。本研究基于從李剛研究結(jié)果，再次通過搜索比對各核酸及蛋白數(shù)據(jù)庫，從水稻基因組序列里選擇與紅麻No.326蛋白同源性最高的水稻POLLENLESS3的3個基因進(jìn)行研究，其基因登陸號分別為為Os05943040，Os03906970和Os09936740。在水稻基因組數(shù)據(jù)庫里有4個MS5同源基因，其功能未被注釋。本研究將挑出來3個基因分別命名為OsMs5-1，OsMs5-2，OsMs5-3，并對這3個基因進(jìn)行了序列分析，通過RNAi基

4、因沉默及超量表達(dá)來研究這3個基因的功能，同時我們還克隆了紅麻的MS5基因，并也作了序列分析及在水稻中超量表達(dá)，為了解決基因工程創(chuàng)造細(xì)胞核雄性不育系的保持問題，我們還對煙草EPSPS1進(jìn)行功能研究，通過對水稻與紅麻MS5基因及煙草EPSPS1的功能研究，得出如下結(jié)果：
　　 1、3個水稻基因的分離與序列分析。我們從水稻分離OsMs5-1，OsMs5-2，OsMs5-3基因全長片段，對水稻OsMs5-1，OsMs5-2，OsMs5-

5、3基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，3個MS5蛋白分別編碼含有299、315和515個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。經(jīng)Scanprosite軟件分析發(fā)現(xiàn)，3個MS5均含有一個TPR結(jié)構(gòu)域(PS50005)，屬TPR蛋白家族成員。序列分析顯示OsMs5-1，OsMs5-2，OsMs5-3基因與擬南芥MS5基因高源同源，以上結(jié)果表明以上OsMs5-1，OsMs5-2，OsMs5-3蛋白是MS5基因的同源基因。
　　 2、為了對OsMs5-1，OsMs5

6、-2，OsMs5-3基因進(jìn)行功能分析，我們通過構(gòu)建水稻OsMs5-1，OsMs5-2，OsMs5-3，3個基因的RNAi干擾表達(dá)載體，并以中花11為受體材料用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻，分別獲得轉(zhuǎn)基因的陽性植株。對干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株T1代以nptⅡ基因片段為探針進(jìn)行Southern分析證明，獲得了轉(zhuǎn)基因陽性植株。對3個基因的RNAi干擾轉(zhuǎn)基因水稻后代進(jìn)行形態(tài)及光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察，結(jié)果顯示，T0代的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)不同程度的不育。轉(zhuǎn)基因植株

7、的花粉也不同于野生型植株花粉。
　　 3、構(gòu)建水稻OsMs5-1、OsMs5-2和OsMs5-33個基因帶GFP標(biāo)記基因的超量表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻。并以粳稻中花11為受體材料，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻，分子鑒定獲得了陽性植株。為了對水稻OsMs5-1、OsMs5-2和OsMs5-3基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，用3個帶GFP的轉(zhuǎn)基因植株的幼苗根尖與愈傷組織壓片置于熒光顯微下觀察綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植株能觀察到被

8、藍(lán)光激發(fā)出耀眼的綠色熒光。
　　 4、為了研究MS5同源基因在紅麻(Hibiscus canabius L.)花藥中的轉(zhuǎn)錄特征，以不育系L23A為試材，基于已知的紅麻MS5基因5'端cDNA序列，采用3'RACE和RT-PCR技術(shù)對該基因全長cDNA序列進(jìn)行了克隆。序列比對分析結(jié)果表明，紅麻花藥組織中同時存在MS5基因2種不同的轉(zhuǎn)錄本，其長度分別為972 bp和1105 bp，依次命名為HcMs5-α和HcMs5-β。這2種轉(zhuǎn)錄

9、本均包含了完整且一致的編碼序列(CDS)，全長為858 bp，預(yù)測編碼的蛋白質(zhì)含有285個氨基酸殘基，相對分子量為32.4 kD，理論等電點為7.62。兩者5'端前972 bp序列完全一致，但3'端的非編碼區(qū)(UTR)長度有所不同，HcMs5-β在第972 bp以后比HcMs5-α多出133 bp的序列，具有選擇性轉(zhuǎn)錄終止的特征。這種轉(zhuǎn)錄終止信號的可選擇性可能與該基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控有關(guān)。
　　 半定量RT-PCR分析紅麻不育系

10、和保持系MS5基因的時空表達(dá)，結(jié)果顯示，MS5基因在不育系和保持系中，在各個組織的表達(dá)沒有差異，其中無論是不育系和保持系，MS5基因在根、花瓣及雙核期花藥有表達(dá)，在莖，葉和單核期花藥，MS5基因的表達(dá)量極低。但據(jù)李剛(2009)的研究，紅麻該基因在蛋白水平上的表達(dá)量，在不育系和保持系之間差異顯著。由此推測可能與該基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控有關(guān)。對紅麻HcMs5基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，對GFP報告基因的轉(zhuǎn)基因植株的幼苗根尖與愈傷組織壓片置于熒光

11、顯微下觀察綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植株能觀察到被藍(lán)光激發(fā)出耀眼的綠色熒光。
　　 5、EPSPS合酶(5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶)是莽草酸途徑中的一個關(guān)鍵酶，是除草劑草甘膦的作用靶標(biāo)。草甘膦通過阻止EPSPS合酶的形成而使莽草酸途徑中止，從而達(dá)到對植物的滅殺作用。草甘膦是一種廣譜型滅生性除草劑，植物中EPSP合成酶的過量表達(dá)或某些活性位點氨基酸的突變對高劑量的草甘膦有較強的耐受性。為了利用基因工程創(chuàng)造細(xì)胞核雄性

12、不育系，對于基因工程創(chuàng)造細(xì)胞核雄性不育系的保持問題，我們設(shè)想以煙草TOB-EPSPSI基因作為篩選標(biāo)記，篩選細(xì)胞核雄性不育后代的不育株與可育株，以解決不育系的保持問題。本研究對煙草的抗除草劑草甘膦TOB-EPSPSI基因進(jìn)行了研究，將煙草的TOB-EPSPSI基因(基因登陸號M61904)構(gòu)建了植物表達(dá)載體，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入水稻。分子鑒定證明煙草TOB-EPSPSI基因被成功整合到粳稻中花11受體材料中。對轉(zhuǎn)基因植株T2代進(jìn)行草甘膦