轉基因突變煙草雄性不育表型分析及分子基礎研究.pdf

1、煙草是重要的生物學模式植物，又是世界上重要的經濟作物，因此煙草基因功能的研究對植物生物學和農業(yè)經濟領域都具有重要的意義。在模式植物擬南芥中，利用雄性不育突變體研究花粉發(fā)育相關基因功能是一種直接有效的策略。通過T-DNA插入的方法可以一次性獲得大量的突變體，用這種創(chuàng)造突變體庫的方法實現(xiàn)對煙草雄性育性相關基因功能的深入研究也是有可能的，因此對于已存在的煙草T-DNA插入雄性不育突變體的研究具有重要的意義。目前兩個煙草二倍體種全基因組測序的完

2、成，為煙草雄性育性相關基因功能的研究提供了豐富的數(shù)據和研究平臺。本研究以一株轉基因T0代雄性不育煙草突變體為研究材料，利用形態(tài)學、細胞學及分子生物學等方法，對該突變體開展組織形態(tài)、細胞學方面的研究。利用TAIL-PCR技術對T-DNA側翼序列進行分離，根據側翼序列提供的基因信息，結合正向和反向遺傳學的方法，具體分析由T-DNA插入而產生雄性不育性狀的可能的基因。通過試驗，得到如下結果:
　　(1)形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)生長時期，突變

3、體與野生型植株在形態(tài)上無明顯差異。但生殖生長階段，野生型成熟的花藥為綠色，大而飽滿，花粉粒多;而不育突變體成熟的花藥深褐色、瘦癟，花粉少而小，形態(tài)異常。野生型花器官比不育花大，且花絲不短于柱頭，但突變體的花絲大多短于柱頭。統(tǒng)計結果顯示不育突變株每個花藥中的平均花粉數(shù)量少，多數(shù)花粉皺縮變小，花粉活力低，離體培養(yǎng)萌發(fā)率僅為10.6％。
　　(2)利用DAPI染色的方法判斷花粉發(fā)育時期，統(tǒng)計確定了野生型煙草和突變體煙草花粉發(fā)育各個時期所

4、對應的花蕾長度，對于以后的細胞學以及分子生物學的研究奠定了一定的基礎。并發(fā)現(xiàn)在花粉發(fā)育的各個階段，突變體的花蕾長度均短于野生型。
　　(3)細胞學觀察結合DAPI染色的結果說明，雄性不育突變的體雄配子的發(fā)育異常出現(xiàn)在四分體釋放以后的單核小孢子期，其敗育特征為:四分體后小孢子形態(tài)異常，部分小孢子與降解不完全的胼胝質發(fā)生粘連，最終這一部分小孢子無法繼續(xù)發(fā)育而降解;二核花粉粒時期，突變體花粉細胞內明顯液泡化，多數(shù)小孢子無法正常進行有絲分

5、裂形成雙核花粉粒，在以后的發(fā)育過程中細胞質物質不斷降解，最后內容物極少或只剩下花粉壁空殼。
　　(4)掃描電鏡觀察花粉外壁形態(tài)，可見野生型花粉壁表面較平滑，不育花粉外壁表面有著豐富的紋飾，大多呈現(xiàn)條紋形，少數(shù)為點狀凹陷。進一步對花粉壁構造進行透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)突變體的柱狀體發(fā)育不良，造成后來頂蓋形成及孢粉素的沉積不均勻。
　　(5)將突變植株與野生型正反交得到代T1都為可育植株，說明不是細胞質遺傳類型。T1種下后自交后對T2

6、代性狀分離情況進行統(tǒng)計，暫時未發(fā)現(xiàn)不育植株，推測種植的植株過少，目前已經重新種下有待進一步統(tǒng)計。
　　(6)通過TAIL-PCR的方法獲得被插入的3段序列，通過生物信息學的方法，在煙草基因組數(shù)據庫Blast確定T-DNA在煙草基因組中的插入位點，確定了3個可能的候選基因:1個為煙草的X轉錄因子基因，T-DNA插入位點位于此基因啟動子區(qū)域內并且插入造成了該區(qū)域60bp堿基的缺失;另外2個是未定義蛋白基因，其中一個T-DNA可能插入到

7、它的3'UTR區(qū)域，另外一個基因只確定了部分轉錄序列，全長序列尚有待RACE擴增。
　　(7)利用qRT-PCR對野生型和不育突變體中三個基因不同部位表達量進行定量分析，發(fā)現(xiàn)X轉錄因子基因在兩個植株中表達差距明顯，又分別對花藥發(fā)育各個時期的三個候選基因的表達量進行動態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)在花粉發(fā)育的整個過程中X轉錄因子基因在突變體中的表達量均明顯低于野生型，另外未知蛋白基因在單核期的表達量遠低于野生型。推測不育突變可能是X基因或者未知蛋白基