華支睪吸蟲(chóng)SERPIN基因的克隆表達(dá)及其功能的初步研究.pdf

1、華支睪吸蟲(chóng)病(clonorchiasis)，亦稱肝吸蟲(chóng)病，是由華支睪吸蟲(chóng)(Clonorchissinensis，C. sinensis)感染引起的一種食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病。該病主要流行于中國(guó)、日本、韓國(guó)、越南及其它東南亞國(guó)家，全世界有將近3,500萬(wàn)人感染，我國(guó)是最主要的流行區(qū)，感染人數(shù)約為1,249萬(wàn)。流行區(qū)的居民生食或食入未煮熟的含有華支睪吸蟲(chóng)活囊蚴的魚(yú)、蝦而感染，反復(fù)感染可使病情加重，導(dǎo)致膽囊炎、膽管炎、膽結(jié)石、肝纖維化甚至肝膽

2、管癌。
　　 近年來(lái)，華支睪吸蟲(chóng)感染率呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)，衛(wèi)生部2001-2004年進(jìn)行的全國(guó)(除臺(tái)灣、香港、澳門(mén)外)人體重要寄生蟲(chóng)病流行現(xiàn)狀調(diào)查結(jié)果顯示，全國(guó)華支睪吸蟲(chóng)感染率平均達(dá)0.58％，流行區(qū)華支睪吸蟲(chóng)感染率為2.04％，與1990年的調(diào)查相比，感染率上升了75％。其原因主要有：改變流行區(qū)居民的飲食習(xí)慣十分困難；追求新鮮、生食或半生食魚(yú)蝦等成為新的飲食時(shí)尚；華支睪吸蟲(chóng)保蟲(chóng)宿主(貓、犬、鼠及其它野生動(dòng)物)的不可控性等。由于魚(yú)是

3、肝吸蟲(chóng)最重要的中間宿主，因此防止魚(yú)感染肝吸蟲(chóng)將對(duì)阻斷該病的傳播起到事半功倍的作用。但目前關(guān)于尾蚴如何侵入魚(yú)體或者在魚(yú)體內(nèi)形成囊壁的機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 已有研究表明，絲氨酸蛋白酶在寄生原蟲(chóng)成囊過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其抑制劑可以顯著降低成囊率，卡氏棘阿米巴的成囊和脫囊都與絲氨酸蛋白酶的作用密切相關(guān)。而絲氨酸蛋白酶作用的發(fā)揮必須受到其抑制劑的精確調(diào)控。事實(shí)上，許多研究已經(jīng)表明寄生蟲(chóng)的絲氨酸蛋白酶抑制劑可以抑制宿主的絲氨酸蛋白

4、酶，在抵抗宿主的免疫中發(fā)揮重要作用，如：馬來(lái)布魯線蟲(chóng)微絲蚴的絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制人體中性粒細(xì)胞中的絲氨酸蛋白酶；曼氏血吸蟲(chóng)和埃及血吸蟲(chóng)的絲氨酸蛋白酶抑制劑在維持自身的生理穩(wěn)定及與宿主的相互作用中發(fā)揮雙重作用。
　　 目前關(guān)于華支睪吸蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶抑制劑的研究，除了genebank中有一條登錄的序列外未見(jiàn)其它報(bào)道。那么，華支睪吸蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶抑制劑是否也是成囊相關(guān)分子?成為我們迫切需要解決的問(wèn)題。
　　 因此，本研究從華

5、支睪吸蟲(chóng)囊蚴cDNA文庫(kù)中識(shí)別華支睪吸蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶抑制劑基因(將其縮寫(xiě)為CsSERPIN)基因，研究免疫學(xué)特性、生物學(xué)活性、階段性表達(dá)及組織定位，為研究囊蚴的成囊機(jī)制及研制魚(yú)用疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 1、研究目的：
　　 從華支睪吸蟲(chóng)囊蚴cDNA文庫(kù)中識(shí)別華支睪吸蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶抑制劑基因(將其縮寫(xiě)為CsSERPIN)，獲得編碼序列(CDS)，表達(dá)重組CsSERPIN蛋白(縮寫(xiě)為rCsSERPIN)并對(duì)其免疫學(xué)特性及生物學(xué)

6、活性進(jìn)行評(píng)價(jià)；比較該基因在華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)和囊蚴階段mRNA和蛋白水平上的表達(dá)差異以及在蟲(chóng)體的定位，為研究囊蚴的成囊機(jī)制及研制魚(yú)用疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 2、研究方法：
　　 2.1 CsSERPIN基因的識(shí)別及全長(zhǎng)序列的獲得
　　 對(duì)本室構(gòu)建的華支睪吸蟲(chóng)囊蚴全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)的表達(dá)序列標(biāo)簽測(cè)序后進(jìn)行UniGene歸并，獲得大批序列。通過(guò)BLASTx比對(duì)獲得編碼CsSERPIN蛋白的質(zhì)粒文庫(kù)的克隆號(hào)。將這些質(zhì)粒導(dǎo)入

7、大腸桿菌(E.coli)DH5α進(jìn)行擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒walking測(cè)序并進(jìn)行序列拼接，BLASTx比對(duì)后確定全長(zhǎng)序列。使用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)CsSERPIN蛋白的分子量、穩(wěn)定性、功能域及高級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)。
　　 2.2基因的克隆表達(dá)和重組蛋白的純化
　　 根據(jù)目的基因的CDS和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以比對(duì)后確定編碼CsSERPIN的文庫(kù)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增CsSERPIN，定向克隆該序列到

8、質(zhì)粒pET-28a(+)，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-CsSERPIN轉(zhuǎn)化E.coli BL21/DE并誘導(dǎo)表達(dá)后，Ni-IDA柱親和層析獲得純化的rCsSERPIN，用小鼠His單抗對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行Western blotting鑒定。
　　 2.3 rCsSERPIN的生物學(xué)特性和功能初步探討
　　 將純化的rCsSERPIN免疫大鼠獲得免疫血清，Wester

9、n blotting觀察免疫血清及感染華支睪吸蟲(chóng)的人和大鼠血清對(duì)相應(yīng)的rCsSERPIN的識(shí)別能力，鑒定rCsSERPIN的免疫反應(yīng)性。將rCsSERPIN行含明膠的SDS-PAGE后用胰蛋白酶水解，觀察其對(duì)胰蛋白酶的作用；rCsSERPIN與胰蛋白酶和囊蚴共孵育，觀察其對(duì)胰蛋白酶誘導(dǎo)的囊蚴脫囊的影響；同時(shí)通過(guò)觀察重組蛋白對(duì)囊蚴脫囊的影響。
　　 2.4 CsSERPIN在華支睪吸蟲(chóng)囊蚴和成蟲(chóng)階段的表達(dá)差異
　　 用Tr

10、izol法分別提取華支睪吸蟲(chóng)囊蚴和成蟲(chóng)的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。以β-actin為內(nèi)參，采用半定量法灰度掃描判斷該基因囊蚴和成蟲(chóng)階段表達(dá)的高低，SYBR GreenⅠ嵌合熒光法行Real Time PCR確定兩階段在mRNA水平上的表達(dá)差異；以rCsSERPIN免疫大鼠獲得的血清以及感染華支睪吸蟲(chóng)的大鼠血清為一抗，Western blotting鑒定CsSERPIN蛋白在囊蚴和成蟲(chóng)階段的表達(dá)。
　　 2.5 CsSERP

11、IN在華支睪吸蟲(chóng)囊蚴和成蟲(chóng)階段的免疫定位
　　 將華支睪吸蟲(chóng)囊蚴、成蟲(chóng)固定后石蠟包埋切片，免疫熒光法觀察CsSERPIN在華支睪吸蟲(chóng)囊蚴和成蟲(chóng)階段的組織定位。一抗用上述制備的初步純化的抗rCsSERPIN的大鼠血清，二抗用熒光標(biāo)記的抗大鼠IgG抗體。熒光顯微鏡下觀察并拍照。
　　 3、研究結(jié)果：
　　 3.1 CsSERPIN基因的全長(zhǎng)序列和生物信息學(xué)分析
　　 從華支睪吸蟲(chóng)囊蚴cDNA文庫(kù)中識(shí)別出兩種絲

12、氨酸蛋白酶抑制劑的編碼基因，克隆號(hào)分別為133f12和84g02，將其暫命名為CsSERPIN1和CsSERPIN2。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，CsSERPIN1編碼區(qū)長(zhǎng)度為1149bp，編碼382個(gè)aa殘基，CsSERPIN2的編碼區(qū)長(zhǎng)度為1161bp，編碼386個(gè)aa殘基。CsSERPIN1和CsSERPIN2均無(wú)信號(hào)肽，均有SERPIN的功能域，但在功能域的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)區(qū)域差異較大。CsSERPIN1無(wú)跨膜區(qū)，CsSERPIN2有跨膜

13、區(qū)，可能為膜蛋白。
　　 3.2 CsSERPIN的基因克隆和重組蛋白表達(dá)純化
　　 重組質(zhì)粒pET28a(+)-CsSERPIN1和pET28a(+)-CsSERPIN2均構(gòu)建成功，在E.coli BL21/DE中均可表達(dá)，且均有可溶性表達(dá)。兩種重組蛋白都不夠穩(wěn)定，與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。用Ni-IDA柱親和層析獲得純化得到純化蛋白，rCsSERPIN1濃度達(dá)3000μg/ml；rCsSERPIN2的濃度為800μg

14、/ml，較難純化，可能與CsSERPIN2基因存在跨膜區(qū)有關(guān)。
　　 3.3重組CsSERPIN蛋白的免疫學(xué)和生物學(xué)特性的初步研究獲得得到大鼠抗rCsSERPIN1和rCsSERPIN2的免疫血清，滴度為均在51,200以上。
　　 重組蛋白rCsSERPIN1和rCsSERPIN2均能夠很好地識(shí)別相應(yīng)的抗血清以及感染肝吸蟲(chóng)的大鼠血清和患者血清。rCsSERPIN1能夠顯著抑制胰蛋白酶對(duì)明膠的水解，且能夠抑制胰蛋白酶對(duì)囊

15、蚴的脫囊壁作用。rCsSERPIN2對(duì)胰蛋白酶不具有明顯的抑制作用。
　　 3.4 CsSERPIN在華支睪吸蟲(chóng)囊蚴和成蟲(chóng)階段的表達(dá)差異
　　 半定量、定量PCR和Western blotting結(jié)果均顯示兩個(gè)CsSERPIN基因在囊蚴階段的表達(dá)均顯著高于成蟲(chóng)階段。囊蚴階段CsSERPIN1基因的mRNA表達(dá)量為成蟲(chóng)階段的3.249倍，囊蚴階段CsSERPIN2的表達(dá)水平為成蟲(chóng)階段的11.314倍。
　　 3.5

16、 CsSERPIN在華支睪吸蟲(chóng)囊蚴階段的免疫定位
　　 免疫熒光結(jié)果顯示，CsSERPIN1在囊蚴主要定位于口吸盤(pán)，此外在皮下實(shí)質(zhì)組織內(nèi)有彌散分布。CsSERPIN2主要分布于囊壁以內(nèi)的蟲(chóng)體表層。
　　 4、研究結(jié)論：
　　 4.1測(cè)序和生物信息學(xué)分析獲得兩個(gè)華支睪吸蟲(chóng)囊蚴CsSERPIN基因的全長(zhǎng)序列，文庫(kù)克隆號(hào)分別為133 f12和84g02。
　　 4.2 rCsSERPIN1和rCsSERPIN2