華支睪吸蟲CsSCCRO基因的發(fā)現(xiàn)及其功能初步研究.pdf

1、華支睪吸蟲成蟲長期寄生于肝膽管部位所引起的疾病稱華支睪吸蟲病，又稱肝吸蟲病，是一種食源性的人獸共患寄生蟲病。 華支睪吸蟲成蟲輕度感染不會產(chǎn)生明顯臨床癥狀，易被忽視，患者長期帶蟲，蟲體的分泌/代謝產(chǎn)物及蟲體本身的機械刺激，對肝膽系統(tǒng)造成慢性損害，可引起膽管局限性擴(kuò)張、膽管上皮增生、管壁增厚、管腔狹窄、膽管炎、膽管肝炎和肝硬化甚至誘發(fā)肝膽管腫瘤。 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示：華支睪吸蟲病并發(fā)膽管癌的發(fā)生率高達(dá)14％-47.6％，并

2、且流行區(qū)膽管癌較肝細(xì)胞癌更多見；病理學(xué)資料表明：華支睪吸蟲成蟲可引起膽管上皮脫落，膽管腺瘤樣增生和炎癥反應(yīng)，晚期在腺瘤樣增生邊緣出現(xiàn)鱗狀化生，膽管的腺瘤樣增生組織產(chǎn)生退化及纖維化和惡性變；我國珠江三角洲地區(qū)的膽管癌患者很多都合并華支睪吸蟲感染，有的甚至在癌組織切片中找到華支睪吸蟲卵碎片，此種癌多數(shù)為低分化癌。 人鱗狀上皮癌腫瘤相關(guān)基因(squamouscellcarcinoma-relatedoncogene，SCCRO)研究發(fā)

3、現(xiàn)，該基因定位于人類染色體3q26.3上，氨基酸序列含有螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)與核轉(zhuǎn)錄因子類癌基因相類似，具有潛在轉(zhuǎn)錄因子作用。SCCRO轉(zhuǎn)染的裸鼠具有形成未分化侵襲瘤的作用，并且與局部的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。SCCRO的大量表達(dá)與人類多種鱗狀上皮癌的侵襲，轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 盡管有充分的證據(jù)表明，華支睪吸蟲的感染是引發(fā)肝膽管癌的一個重要因素，但是至今仍缺乏明確的分子水平的實驗證據(jù)；另一方面，華支睪吸蟲是否存在與人鱗狀上皮

4、癌腫瘤相關(guān)基因相類似的基因，是否也具有與其相類似的作用?都值得進(jìn)一步探討。 研究目的從華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫中篩選出與人鱗狀上皮癌腫瘤相關(guān)基因相類似的基因，探討其與肝膽管癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為華支睪吸蟲感染引起肝膽管腫瘤提供分子生物學(xué)依據(jù)，同時豐富華支睪吸蟲基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究。 研究方法1華支睪吸蟲CsSCCRO基因的發(fā)現(xiàn)和生物信息學(xué)分析從華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫測序后unigene歸并、拼接，獲得與人鱗狀

5、上皮癌相關(guān)腫瘤基因相類似的基因，暫命名為CsSCCRO。測序、分析是否為全長基因，然后利用生物信息學(xué)分析軟件對此基因的cDNA序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能分析，包括核酸水平和氨基酸水平的同源性分析、以及推導(dǎo)的CsSCCRO蛋白的理化性質(zhì)及空間結(jié)構(gòu)分析。 2華支睪吸蟲CsSCCRO基因克隆、表達(dá)和Western-blotting鑒定 2.1華支睪吸蟲成蟲CsSCCRO基因的擴(kuò)增、克隆 根據(jù)目的基因的ORF和原核表達(dá)質(zhì)粒

6、pET-30a(+)設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增CsSCCRO基因的cDNA全長編碼區(qū)。限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、EcoRⅤ雙酶切空質(zhì)粒pET-30a(+)和PCR產(chǎn)物，T4連接酶連接。用PCR、酶切及測序鑒定。 2.2華支睪吸蟲成蟲CsSCCRO基因的表達(dá)和純化 將pET-30a(+)-CsSCCRO重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL-21中表達(dá)，IPTG誘導(dǎo)后超聲裂解破碎，最后用Ni-NTAAgarose蛋白純化柱純化目的蛋白，核酸蛋白

7、定量分析儀DU530(Beckman)測濃度。 2.3華支睪吸蟲成蟲CsSCCRO蛋白的Western-blotting鑒定采用SDS-PAGE電泳和Westernblotting方法，一抗分別用長期感染華支睪吸蟲的貓血清和輕度感染的大鼠血清(均為1：100稀釋)，以GST1為陽性對照，來檢測CsSCCRO蛋白的免疫原性。 3華支睪吸蟲CsSCCRO的細(xì)胞生物學(xué)功能初步研究 3.1CsSCCRO蛋白刺激大鼠卵圓細(xì)

8、胞的作用探討 將卵圓細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后按一定濃度加入目的蛋白刺激，以PBS為陰性對照進(jìn)行MTT試驗。在細(xì)胞生長的12h、24h、36h、48h、60h等五個時間點檢測細(xì)胞492nm的吸光度，來反映細(xì)胞的生長變化；提取實驗組和對照組細(xì)胞的總mRNA，通過RT-PCR檢測腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因c-myc和CD44表達(dá)量的變化。 3.2將CsSCCRO基因轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞和大鼠肝卵圓細(xì)胞作用探討構(gòu)建pEGFP-N

9、1-CsSCCRO真核重組質(zhì)粒，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-CsSCCRO入Hela細(xì)胞和大鼠肝卵圓細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡觀察CsSCCRO的表達(dá)，為進(jìn)一步的功能研究打下基礎(chǔ)。 研究結(jié)果1華支睪吸蟲CsSCCRO基因的編碼序列結(jié)構(gòu)分析從華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)與人鱗狀上皮癌腫瘤相關(guān)基因相類似的基因，暫命名為CsSCCRO；CsSCCRO是完整的全長基因，該基因全長1218bp。其ORF含堿基780bp，起始密碼子為ATG

10、，終止密碼子為TGA，編碼259個氨基酸。其推導(dǎo)氨基酸序列與人鱗狀上皮癌基因編碼蛋白一致性達(dá)到50％，保守功能域分析發(fā)現(xiàn)該序列含有螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，與核轉(zhuǎn)錄因子類癌基因相似；其編碼氨基酸理論分子量為30500，理論PI值5.46。 2華支睪吸蟲CsSCCRO基因克隆、表達(dá)和Western-blotting鑒定用設(shè)計的引物PCR從cDNA文庫中擴(kuò)增CsSCCRO編碼區(qū)cDNA序列，用瓊脂糖電泳鑒定在略大于750bp處

11、，測序確定為780bp。定向克隆獲得的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-CsSCCRO經(jīng)PCR、雙酶切和/或測序證實構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒在IPTG終濃度1mmol/L，28℃下誘導(dǎo)表達(dá)可溶性重組融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE顯示與目的蛋白分子量相符，重組蛋白經(jīng)親和層析純化后得到純化后的目的蛋白。 Westernblotting證實長期自然感染華支睪吸蟲的貓血清能與原核表達(dá)的CsSCCRO蛋白相結(jié)合，說明在華支睪吸蟲長期感染過程中

12、目的蛋白可以刺激機體產(chǎn)生抗體，具有一定的免疫原性。對于輕度感染華支睪吸蟲的大鼠血清則不能與目的蛋白相結(jié)合，提示目的蛋白不宜作為感染早期診斷分子。 3華支睪吸蟲CsSCCRO的細(xì)胞生物學(xué)功能初步研究 CsSCCRO蛋白刺激大鼠卵圓細(xì)胞的MTT結(jié)果顯示：目的蛋白在適當(dāng)?shù)臐舛认吕诩?xì)胞大鼠肝卵圓細(xì)胞的生長，。半定量PCR結(jié)果表明：目的蛋白刺激后c-myc的表達(dá)量輕度升高，而CD44表達(dá)量則無明顯變化。 CsSCCRO能

13、夠在Hela細(xì)胞中高效表達(dá)，而在大鼠肝卵圓細(xì)胞中則很難見到綠色熒光蛋白的表達(dá)。這一方面可能與CsSCCRO蛋白對大鼠肝卵圓細(xì)胞有一定的毒性有關(guān)，另一方面，也可能與大鼠肝卵圓細(xì)胞自身特性不適于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染有關(guān)。 研究結(jié)論1.首次在華支睪吸蟲中發(fā)現(xiàn)了與人鱗狀上皮癌相關(guān)腫瘤基因同源性較高的基因，暫命名為CsSCCRO。 2.CsSCCRO蛋白能夠促進(jìn)大鼠肝卵圓細(xì)胞的生長，并且使腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因c-myc的表達(dá)量增加。這提示CsS