抗華支睪吸蟲成蟲抗原McAb的制備及其功能的研究.pdf

1、目的：利用雜交瘤細胞技術(shù)制備抗華支睪吸蟲成蟲抗原單克隆抗體并對其進行功能鑒定，以期能獲得敏感性高、特異性強的檢測肝吸蟲循環(huán)抗原的工具，為華支睪吸蟲病的診斷標準化和流行病學調(diào)查奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：從感染華支睪吸蟲的麥穗魚中分離囊蚴并感染豚鼠，獲取華支睪吸蟲成蟲并制備成蟲抗原。以成蟲抗原免疫小鼠，經(jīng)過三輪基礎(chǔ)免疫和一次加強免疫后，使免疫小鼠脾細胞具有穩(wěn)定分泌抗華支睪吸蟲抗體的能力。在融合劑PEG的作用下將免疫小鼠脾細胞與Sp2/

2、0骨髓瘤細胞進行融合，獲得雜交瘤細胞。在HAT和HT選擇培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，以間接ELISA法對獲得的雜交瘤細胞進行克隆化篩選。對穩(wěn)定分泌抗華支睪吸蟲McAb株采用動物體內(nèi)誘生的方法進行制備。以飽和硫酸銨沉淀法和FPLC法對獲得的單抗腹水進行純化和純度鑒定。以間接ELISA法對單抗腹水進行效價測定、亞類測定及特異性檢測，Dot-blot法檢測單抗免疫學活性。用IFAT進行單抗對蟲體的識別部位觀察，用免疫組化觀察單抗與感染小鼠肝臟組織中抗

3、原的結(jié)合。
　　 結(jié)果：經(jīng)過動物免疫、細胞融合、選擇性培養(yǎng)，克隆化篩選后獲得1株穩(wěn)定分泌抗華支睪吸蟲成蟲抗原的單克隆抗體株，命名為D10，該細胞生長良好，穩(wěn)定性好，經(jīng)過連續(xù)傳代20次，-70℃冰箱保存后復蘇仍然具有良好生長狀態(tài)及穩(wěn)定分泌抗體的能力；用此株單抗制備小鼠腹水液，純化后腹水蛋白濃度為2.2mg/ml，抗體效價檢測達到1：200000以上，單抗亞類鑒定顯示為IgG1類，F(xiàn)PLC法觀察見純化單抗D10的洗脫峰只有一個單一峰

4、，而且對稱性好，純度達到90％以上。SDS-PAGE電泳顯示單抗的重鏈分子量為50KDa，輕鏈分子量為26KDa。ELISA法檢測其與豬囊尾蚴、弓形蟲、瘧原蟲和日本血吸蟲抗原無交叉反應(yīng)。
　　 免疫熒光實驗觀察到單抗D10能與華支睪吸蟲蟲體的表皮及蟲卵結(jié)合。免疫組化顯示單抗D10可與病變肝臟組織中匯管區(qū)及周圍間質(zhì)中的抗原結(jié)合。
　　 結(jié)論：(1)獲得穩(wěn)定分泌抗華支睪吸蟲成蟲抗原單克隆抗體株1株，命名為D10。(2)單克隆