華支睪吸蟲病綜合防治措施的研究.pdf

1、全文分為五部分: 1.華支睪吸蟲成蟲和囊蚴cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定 目的構(gòu)建華支睪吸蟲和囊蚴cDNA表達(dá)文庫(kù)，為篩選特異診斷抗原和疫苗候選抗原奠定基礎(chǔ)。方法提取華支睪吸蟲和囊蚴總RNA：用Clontech公司SMARTTMcDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒操作方法，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA：PCR產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶K消化、純化后，進(jìn)行SfiI酶切：用ChromaSpin400柱將酶切產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)分離，經(jīng)1.1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收0

2、.4～4kb的組分，并與λTriplEx2載體連接：連接產(chǎn)物經(jīng)體外蛋白包裝，產(chǎn)生未擴(kuò)增文庫(kù)：檢測(cè)未擴(kuò)增文庫(kù)滴度和重組效率后，進(jìn)行文庫(kù)的擴(kuò)增，并測(cè)定擴(kuò)增文庫(kù)的滴度：隨機(jī)挑取9個(gè)噬菌斑，用載體克隆位點(diǎn)兩端的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)的質(zhì)量。結(jié)果華支睪吸蟲未擴(kuò)增文庫(kù)滴度達(dá)7.5×107pfu/ml，擴(kuò)增文庫(kù)滴度達(dá)2.7×108pfu/ml：用載體兩端的引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示：所選10個(gè)噬菌體中均含有重組的cDNA，其

3、中1kb以上的有3個(gè)，700bp的有3個(gè)、500bp的有2個(gè)：囊蚴未擴(kuò)增文庫(kù)滴度達(dá)7.0×107pfu/ml，擴(kuò)增文庫(kù)滴度達(dá)2.5×108pfu/ml：用載體兩端的引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示：擴(kuò)增文庫(kù)中，含1kb以上的占30％左右，1kb-500bp占69％。結(jié)論已成功地獲得高質(zhì)量的華支睪吸蟲/囊蚴cDNA表達(dá)文庫(kù)。 2華支睪吸蟲可溶性蛋白基因的克隆和表達(dá) 目的通過(guò)篩選cDNA文庫(kù)識(shí)別華支睪吸蟲新基因；克隆并構(gòu)建華支睪

4、吸蟲分泌蛋白重組表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究其功能及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法對(duì)華支睪吸蟲cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，通過(guò)Blastn程序進(jìn)行序列比對(duì)，識(shí)別華支睪吸蟲新基因，并應(yīng)用Motifscan，NCBIConservedDomainSearch等程序?qū)ζ溥M(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果成功克隆和識(shí)別了5個(gè)分泌蛋白基因：①附睪分泌蛋白E1含475bp的核酸序列，編碼153aa，理論分子量為16.9kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為6.19，疏水氨基酸(AILFWV)占

5、36％，帶電荷氨基酸(RKHYCDE)占30％，極性氨基酸(NCQSTY)占28％，酸性氨基酸(DE)和堿性氨基酸(KR)各占9％。經(jīng)BLAST分析：該蛋白屬于ML域(MD-2-relatedlipid-recognition)家族。②CsSP16.4，含725bp；應(yīng)用VecterNTI分析，理論分子量為16.6kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為6.44，疏水氨基酸(AILFWV)占36％，帶電荷氨基酸(RKHYCDE)占29.％，極性氨基

6、酸(NCQSTY)占28.8％，酸性氨基酸(DE)8.65％和堿性氨基酸(KR)占9.21％。應(yīng)用NCBI站點(diǎn)的ORFFinding分析發(fā)現(xiàn)其含4個(gè)可能的ORF，其中最長(zhǎng)的ORF，從第42到第494bp，起始密碼為ATG、終止密碼為TAG，完整閱讀框含450bp，編碼150aa，③CsCrSP，含689bp；應(yīng)用VecterNTI分析，理論分子量為21.1kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為8.06，疏水氨基酸(AILFWV)占32.45％，帶

7、電荷氨基酸(RKHYCDE)占35.7％，極性氨基酸(NCQSTY)占30.52％，酸性氨基酸(DE)9.68％和堿性氨基酸(KR)占12.58％。應(yīng)用NCBI站點(diǎn)的ORFFinding分析發(fā)現(xiàn)其含4個(gè)可能的ORF，其中最長(zhǎng)的ORF，從第47到第610bp，起始密碼為ATG、終止密碼為TAG，完整閱讀框含561bp，編碼187aa，④CsSP25.2，含906bp；應(yīng)用VecterNTI分析，理論分子量為25.2kDa，理論等電點(diǎn)(pI

8、)為7.23，疏水氨基酸(AILFWV)占35.17％，帶電荷氨基酸(RKHYCDE)占34.99％，極性氨基酸(NCQSTY)占27.45％，酸性氨基酸(DE)占10.05％和堿性氨基酸(KR)占12.36％。應(yīng)用NCBI站點(diǎn)的ORFFinding分析發(fā)現(xiàn)其含4個(gè)可能的ORF，其中最長(zhǎng)的ORF，從第83到第744bp，起始密碼為ATG、終止密碼為TAG，完整閱讀框含660bp，編碼220aa.⑤CsSP，長(zhǎng)809bp有一個(gè)可能的最大開

9、放閱讀框，包括435bp的核酸序列，編碼145aa，理論分子量為16.4kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為8.39，疏水氨基酸(AILFWV)占35.29％，帶電荷氨基酸(RKHYCDE)占31.95％，極性氨基酸(NCQSTY)占28.38％，酸性氨基酸(DE)11.97％和堿性氨基酸(KR)占15.38％。結(jié)論發(fā)現(xiàn)華支睪吸蟲分泌蛋白基因，為作為診斷及疫苗候選抗原提供了依據(jù)。 3魚體肝吸蟲囊蚴快速檢測(cè)試劑盒的研制 目的研制華

10、支睪吸蟲囊蚴金標(biāo)快速診斷試劑盒，檢測(cè)及監(jiān)控市場(chǎng)及飯店鮮魚體內(nèi)華支睪吸蟲囊蚴的感染情況，為廣大食“魚生”的消費(fèi)者放心品嘗美味佳肴。方法以華支睪吸蟲囊蚴水溶性抗原作為診斷試劑，制備膠體金免疫層析檢測(cè)盒(ICT)，檢測(cè)血清和粘液中華支睪囊蚴特異的IgG，并與常規(guī)胃蛋白酶消化檢測(cè)法相比較。絞碎魚體，用胃蛋白酶消化，分離囊蚴，用PBS洗3次，加液氮，研磨成粉，再加入4倍體積的含0.1％d疊氮鈉的碳酸鹽包被緩沖液，凍融冰浴勻漿4次，每次5分鐘，4℃

11、，5000g離心10分鐘，分離上清，測(cè)得蛋白濃度約為0.5mg/ml。用BioDot點(diǎn)膜系統(tǒng)將魚IgM、抗原(制備的華支睪吸蟲囊蚴水溶性抗原)，在層析膜上點(diǎn)樣成陽(yáng)性對(duì)照線、檢測(cè)線，將標(biāo)記好的膠體金溶液均勻噴灑在玻璃纖維條上保存，然后把它們與兩個(gè)強(qiáng)力吸水條壓貼在塑料支持底片上，用切割機(jī)均勻切成寬度為0.5cm的檢測(cè)條，經(jīng)高溫(50℃)和干燥處理后，裝入特制的塑料盒中，組裝成ICT檢測(cè)試劑盒，干燥密封包裝。結(jié)果實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確診的華支睪吸蟲魚體

12、血清IgM，檢測(cè)的敏感性均為100％。結(jié)論檢測(cè)華支睪吸蟲感染的ICT抗體檢測(cè)技術(shù)，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、安全，優(yōu)于傳統(tǒng)鏡檢，非常適合應(yīng)用于市場(chǎng)檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。 4滅螺1號(hào)現(xiàn)場(chǎng)滅螺的效果觀察目的觀察殺螺藥物1號(hào)對(duì)螺螄的殺滅作用及對(duì)水生生物和環(huán)境的影響。方法藥物殺螺①點(diǎn)狀法：取殺螺藥物10克，與等量的黏土混均，裝進(jìn)一個(gè)塑料管內(nèi)，在管的周圍均勻的達(dá)4個(gè)直徑為5毫米的小孔，用繩索系住一端，幫在木棍上或系在石塊上，固定在水中，離

13、池底10厘米左右。每個(gè)管離池邊1米，管間間隔為3米。②噴灑法：先計(jì)算池塘的水體積，按照1.5ppm的濃度稱量所需殺螺藥物1號(hào)的量，先溶于水中，再進(jìn)行全池噴灑。藥物副作用①對(duì)魚類和其他水生動(dòng)物的影響把蝌蚪和小魚放在漁缸中，分別加入不同濃度殺螺藥物，觀察藥物對(duì)他們的影響。②觀察全池噴灑對(duì)魚類和其他水生動(dòng)物及水中浮游生物的影響。結(jié)果①點(diǎn)狀法殺螺，在藥物防治3小時(shí)后，螺開始死亡，8小時(shí)后死亡率為50％，到24小時(shí)時(shí)達(dá)99％，對(duì)蝌蚪和小魚存活無(wú)影

14、響；全池噴灑法，5小時(shí)開始死亡，24小時(shí)后死亡率100％。蝌蚪、魚及水上浮游生物沒有影響。結(jié)論1.5ppm殺螺藥物對(duì)螺具有殺滅作用，而對(duì)蝌蚪、魚及水上浮游生物等沒有影響。 5殺蟲1號(hào)現(xiàn)場(chǎng)殺魚體囊蚴的效果觀察 目的觀察殺蟲1號(hào)對(duì)魚體內(nèi)囊蚴的殺滅作用及藥物的作用途徑。方法利用培養(yǎng)液(任氏液)培養(yǎng)囊蚴，觀察GFP在蟲體代謝的途徑；預(yù)試驗(yàn)：分離魚體中囊蚴，選取活力較強(qiáng)的囊蚴利用臺(tái)氏液進(jìn)行培養(yǎng)，觀察殺蟲1號(hào)對(duì)體外囊蚴的作用效果；正