華支睪吸蟲分泌-排泄抗原致肝纖維化的實驗研究.pdf

1、華支睪吸蟲病(clonorchiasis)，亦稱肝吸蟲病，是由華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis，C．sinensis)感染引起的一種食源性人獸共患寄生蟲病，流行于中國、韓國、及其它東南亞國家，全世界有將近3500萬人感染華支睪吸蟲，我國是最主要的流行區(qū)，感染人數(shù)約為1249萬。華支睪吸蟲病主要流行于有生食淡水魚蝦習慣的地區(qū)，生食或食入未煮熟的含囊蚴的魚、蝦后華支睪囊蚴在十二指腸脫囊移入人或動物肝膽管中寄生，壽命可長達2

2、0多年，并可反復感染持續(xù)加重。因此，對華支睪吸蟲的致病機制進行研究，特別是闡明華支睪吸蟲感染引起肝纖維化或肝硬化的分子機制，對深入了解和防治華支睪吸蟲病具有非常重大的科學意義。 1.研究目的和意義基于CsESAs，特別是磷脂酶類可能在華支睪吸蟲的致病方面起重要作用，本課題將以下列研究為目標，初步探討CsESAs及其組分蛋白在華支睪吸蟲致肝纖維化／肝硬化過程中所起的作用. 2.CsESAs致大鼠肝纖維化的研究實驗組大鼠用含

3、DMEM的CsESAs腹腔注射，豬血清腹腔注射為陽性對照、DMEM腹腔注射為陰性對照，同時設立免疫攻擊組(先以佐劑乳化后的CsESAs皮下注射，動物產(chǎn)生抗體后用相同劑量的CsESAs腹腔注射)。動物取血后處死，制備肝臟石蠟切片，HE染色和masson染色觀察肝臟病理變化；熒光免疫組織化學法觀察CsESAs在肝臟中的定位和α-SMA在在肝臟中的表達。ELISA法檢測各組動物血清中抗CsESAs抗體滴度。 3.CsESAs刺激體外培

4、養(yǎng)的人肝星狀細胞株LX-2增殖和活化用含DMEM的CsESAs刺激體外培養(yǎng)的人類肝星狀細胞株LX-2，免疫細胞化學法確定CsESAs是否與人類肝星狀細胞株LX-2細胞膜的結(jié)合；應用MTT法測定CsESAs對LX-2細胞有無增殖作用并用流式細胞儀分析CsESAs對細胞周期的影響；半定量RT-PCR和分子探針(molecular beacon)分析CsESAs對細胞活化情況的影響。 4.兩個磷脂酶基因(CsLPAP、CsGⅢsPLA

5、2)的生物信息學分析及其克隆、表達、純化華支睪吸蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫進行表達序列標簽(expression sequence tag，EST)隨機測序和unigene歸并，獲得一大批華支睪吸蟲成蟲全長基因，用BLASTx方法搜索GenBank中與之同源的蛋白序列，從中識別出溶血磷脂酸特異性磷脂酶(CsLPAP)和Ⅲ型分泌型磷脂酶A2(CsGⅢsPLA2)。利用生物信息學軟件對這兩個基因和其它物種已知的同名基因序列進行同源性比對；分析蛋

6、白分子的組成、功能域、活性位點等，進而預測其生物學功能。應用分子克隆技術分別構建兩個基因的原核表達質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達，用親和層析技術純化目的蛋白，并做SDS-PAGE分析。 5.兩個磷脂酶為華支睪吸蟲成蟲分泌／排泄抗原的鑒定應用Western blotting方法，分別用華支睪吸蟲成蟲ESAs的大鼠免疫血清、重組蛋白的大鼠免疫血清，以及免疫前的大鼠陰性血清作為一抗對華支睪吸蟲成蟲的ESAs進行識別；同時用相同的抗體對兩個重組

7、蛋白分別進行識別，DAB(二氨基聯(lián)苯胺)法顯色。 研究結(jié)果： 1.CsESAs的收集、抗體制備成蟲培養(yǎng)12h收集的CsESAs蛋白含量為0.2mg/mL，SDS-PAGE顯示CsESAs分子量主要在7-66kDa之間，成分復雜。用CsESAs分別免疫大鼠和小鼠，得到的抗CsESAs多克隆抗體效價分別為1：12800和1：9600。 2.CsESAs致肝纖維化動物模型的建立肝臟石蠟切片masson染色后可觀察到注射豬

8、血清的標準陽性組8只大鼠均表現(xiàn)出典型的肝硬化特征；實驗組大鼠均表現(xiàn)出肝臟纖維的增生，部分大鼠肝小葉出現(xiàn)明顯的纖維間隔；免疫攻擊組亦表現(xiàn)出肝臟纖維的增生但程度較實驗組輕；陰性對照組肝組織無病理變化。熒光免疫組織化學法觀察到CsESAs在實驗組、免疫攻擊組大鼠肝臟的血管內(nèi)壁和肝竇內(nèi)皮均有附著；α-SMA在陽性組、實驗組大鼠肝臟中的表達明顯較免疫攻擊組、陰性對照組高。間接ELISA顯示免疫攻擊組動物血清中抗CsESAs抗體滴度遠高于實驗組，陽

9、性組和陰性對照組未檢測到抗CsESAs抗體。以上結(jié)果表明CsESAs可以直接誘導大鼠肝臟發(fā)生纖維增生并發(fā)展為肝硬化。 3.CsESAs刺激體外培養(yǎng)的人類肝星狀細胞株LX-2增殖和活化的分析熒光免疫細胞化學法結(jié)果顯示CsESAs可與人肝星狀細胞LX-2細胞膜結(jié)合。MTT法顯示CsESAs對LX-2細胞的增殖作用在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性，流式細胞儀對細胞周期的分析表明CsESAs可促進LX-2細胞進入增殖期(G2+S期)；半定量RT

10、-PCR分析了CsESAs作用后的LX-2細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP2)表達量均有增加，特異性結(jié)合與人類Ⅲ型膠原蛋白mRNA的分子探針(molecular beacon)也顯示了與之相一致的結(jié)果，提示CsESAs對體外培養(yǎng)的人類肝星狀細胞株LX-2具有促進增殖和活化的作用。 4.兩個磷脂酶基因(CsLPAP、CsGⅢsPLA2)的生物信息學分析及其克隆、

11、表達、純化CsLPAP基因的ORF從第1位到1326位含1326bp，終止密碼為’FAG，編碼441個氨基酸，理論分子量為48.8kDa，1aa-18aa為分泌信號肽序列。多重序列比對結(jié)果顯示CsLPAP的氨基酸序列與日本血吸蟲、斑馬魚、人、小鼠、猩猩的LPAP氨基酸序列一致性分別為45％、32％、29％、27％、28％。CsLPAP具有酸性磷脂酶共有的N端序列LXXVXXVXRHGXRXP且其氨基酸序列中24Gln-362Glu為組氨

12、酸活性磷脂酶的催化區(qū)域。此基因序列已獲GenBank登錄號：DQ974197。雙酶切和測序證實pET-28a-CsLPAP重組質(zhì)粒構建成功，原核表達后12％SDS-PAGE分析顯示目的條帶分子量在45kDa-66.2kDa之間，與理論分子量相符。菌體超聲裂解后上清中有相應的表達條帶，超聲裂解后的上清液經(jīng)His結(jié)合樹脂親和層析純化，SDS-PAGE分析顯示獲得了純度較高的重組蛋白。 CsGⅢsPLA2基因的ORF從第57位到941位含88

13、5bp，起始密碼為ATG，終止密碼為TGA，編碼294個氨基酸，理論分子量為33.7kDa，1aa-19aa為分泌信號肽序列。 結(jié)論： 1.以CsESAs腹腔注射Wistar大鼠發(fā)現(xiàn)CsESAs可以致大鼠肝纖維化，進一步的研究發(fā)現(xiàn)HSC活化是CsESAs致肝纖維化產(chǎn)生的重要原因，但抗原-抗體復合物不是CsESAs引起HSC的活化和肝纖維化的主要途徑。 2.CsESAs可與體外培養(yǎng)的人肝星狀細胞株LX-2結(jié)合，促進

14、LX-2細胞進入G2和S期，并增加細胞內(nèi)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP2表達，說明CsESAs可促進LX-2細胞的增殖、活化。 3.成功構建了pET-28a-CsLPAP和pET-28a-CsGⅢsPLA2原核表達載體，細菌培養(yǎng)物經(jīng)過IPTG誘導表達出重組融合蛋白，用親和層析方法獲得純化的CsLPAP和CsGⅢsPLA2重組蛋白。 4.免疫印跡分析提示CsLPAP和CsGⅢsPLA2兩個蛋白均為CsESAs成分，其中CsLP

15、AP主要定位于蟲體的消化、生殖系統(tǒng)，進一步證明CsLPAP是華支睪吸蟲的ESA。CsGⅢsPLA2不僅氨基酸序列具有GⅢsPLA2的特征，而且CsGⅢsPLA2重組蛋白具有水解蛋黃卵磷脂的活性。 　　5.CsLPAP和CsGⅢsPLA2蛋白均可以與LX-2細胞結(jié)合，但只有CsGⅢsPLA2重組蛋白對LX-2細胞有促進增殖和活化的作用，提示該蛋白可能是致宿主肝纖維化的有效成分之一。 6.用蛋白組學技術對華支睪吸蟲成蟲的分泌／排泄