華支睪吸蟲MYND-ZF基因的克隆、表達(dá)及免疫學(xué)功能的初步研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室多年來從事華支睪吸蟲功能基因組學(xué)的研究，成功建立了華支睪吸蟲cDNA質(zhì)粒文庫，為深入探討華支睪吸蟲與膽管癌的相互關(guān)系打下了基礎(chǔ)?；阡\脂蛋白在部分癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用，本文從華之睪吸蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫中篩選出一個MYND型鋅指蛋白(MYND-ZF)基因，深入探討其結(jié)構(gòu)和功能，以期為華支睪吸蟲在膽管癌致病機(jī)制的系統(tǒng)研究中奠定一定的基礎(chǔ)。
　　 研究目的：
　　 從華支睪吸蟲成蟲的cDNA文庫中篩選出MYND-Z

2、F基因，通過生物信息學(xué)相關(guān)分析軟件預(yù)測MYND型鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特征。
　　 利用基因工程技術(shù)對該基因進(jìn)行原核克隆、表達(dá)，獲得重組MYND-ZF蛋白，制備特異性抗體。
　　 確定華支睪吸蟲MYND-ZF蛋白(CsMYND-ZF)的組織定位，初步推測其可能的生物學(xué)功能。
　　 研究方法：
　　 1 CsMYND-ZF基因生物信息學(xué)的分析
　　 利用BLASTx方法搜索GenBank中的其他物種同

3、源蛋白序列，從華支睪吸蟲成蟲的cDNA文庫中識別出MYND-ZF基因，并進(jìn)行多序列的同源性比對，分析該蛋白在進(jìn)化過程中的規(guī)律。利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件如SignalP、Motifscan、TargetP、Predictprotein等對MYND-ZF進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的分析，對CsMYND-ZF的空間結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測。
　　 2 CsMYND-ZF基因的重組、蛋自純化和免疫特性分析
　　 2.1 CsMYND-ZF基因的重組

4、
　　 依據(jù)目的基因的開放閱讀框(ORF)和質(zhì)粒pET-28a(+)酶切位點(diǎn)特點(diǎn)，通過PCRdesign和DNAClub兩個軟件設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出MYND-ZF基因，利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ對PCR產(chǎn)物和空質(zhì)粒pET-28a(+)雙酶切，利用T4連接酶連接。然后PCR、雙酶切和測序鑒定重組質(zhì)粒。
　　 2.2 CsMYND-ZF蛋白的表達(dá)和純化
　　 將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-CsMYND-

5、ZF轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21/DE3，在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)融合蛋白His-CsMYND-ZF，經(jīng)SDS-PAGE鑒定后，利用His柱進(jìn)行融合蛋白的純化。
　　 2.3重組蛋白CsMYND-ZF的免疫特性分析
　　 2.3.1免疫大鼠血清的制備
　　 用純化后的重組蛋白(rCsMYND-ZF)免疫SD大鼠，制備含有抗rCsMYND-ZF抗體的免疫血清，并對大鼠血清進(jìn)行預(yù)吸附。
　　 2.3.2感染華支睪吸蟲

6、血清的制備
　　 從麥穗魚中收集華支睪吸蟲囊蚴，通過灌胃感染SD大鼠，成功后取血，分離的血清于-80C保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.33檢測SD大鼠產(chǎn)生抗體的趨勢
　　 通過ELISA方法，檢測rCsMYND-ZF免疫SD大鼠產(chǎn)生特異性抗體的動態(tài)變化。
　　 2.3.4 CsMYND-ZF的免疫特性分析
　　 利用Western Blotting方法，以rCsMYND-ZF免疫大鼠血清和華支睪吸蟲感染病人

7、的血清為一抗，對純化的rCsMYND-ZF的免疫原性和免疫反應(yīng)性進(jìn)行分析。
　　 2.3.5 CsMYND-ZF對華之睪吸蟲病的診斷價值
　　 利用ELISA方法，隨機(jī)選取30份華支睪吸蟲感染者的血清，20份日本血吸蟲感染者的血清，14份感染肺吸蟲感染者的血清，30份健康人的血清，比較rCsMYND-ZF與成蟲粗抗原在診斷上的敏感性，以及與日本血吸蟲和肺吸蟲感染者血清的交叉反應(yīng)。
　　 3 CsMYND-ZF在華

8、支睪吸蟲發(fā)育不同時期表達(dá)和定位的研究
　　 通過提取囊蚴、蟲卵及成蟲階段的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板利用特異引物擴(kuò)增目的基因，了解目的基因在不同時期的表達(dá)情況。以抗rCsMYND-ZF大鼠血清作為一抗，對華支睪吸蟲的成蟲、囊蚴石蠟組織切片進(jìn)行蛋白的組織定位。
　　 4華支睪吸蟲MYND-ZF的真核細(xì)胞表達(dá)
　　 4.1 CsMYND-ZF的真核重組及鑒定
　　 從成蟲cDNA文庫當(dāng)中

9、擴(kuò)增目的基因，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-CsMYND-ZF。經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定重組質(zhì)粒。
　　 4.2 CsMYND-ZF的真核表達(dá)和鑒定
　　 通過脂質(zhì)體法將pEGFP-N1-CsMYND-ZF轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，利用倒置熒光顯微鏡觀察培養(yǎng)24 h和48 h的表達(dá)情況，比較與空載體pEGFP-N1細(xì)胞表達(dá)的差異。通過RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N1-CsMYND-ZF的HeLa細(xì)胞中CsMYN

10、D-ZF基因在mRNA水平的轉(zhuǎn)錄情況。利用膜蛋白提取試劑盒提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的膜蛋白，以CsMYND-ZF免疫大鼠血清為一抗，二抗為羊抗大鼠IgG-HRP，利用Western Blotting鑒定蛋白水平的表達(dá)情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1 CsMYND-ZF基因生物信息學(xué)的分析
　　 該基因全長1,847bp，Blastx分析其具有完整的開放閱讀框(ORF)，ORF為21位開始至第1,460位，起始密碼

11、為ATG，終止密碼為TAA，編碼479個氨基酸。等電點(diǎn)和理論分子量分別是6.35和54.8kDa。PredictProtein預(yù)測推測蛋白序列二級結(jié)構(gòu)中β折疊(E)、α螺旋(H)和無規(guī)則卷曲(L)的比例分別是4.18％、56.37％、39.46％。拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析該蛋白含有一個跨膜區(qū)：S102FPIYTLLYHELLVANLL119，N端位于膜內(nèi)(i)，C端位于膜外(o)。Motifscan預(yù)測推測蛋白可能含有cAMP/cGMP依賴的蛋白

12、激酶磷酸化位點(diǎn)，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。InterProScan顯示該蛋白鏈中aa434～aa470屬于MYND型鋅指結(jié)構(gòu)域，推測其是鋅指蛋白家族中的一員。
　　 2 CsMYND-ZF基因克隆、表達(dá)及免疫特性分析
　　 通過特異性引物從成蟲cDNA中擴(kuò)增出目的基因片段，通過電泳鑒定DNA條帶在1,500bp左右。重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-CsMYND-ZF經(jīng)PCR

13、、雙酶切及測序后證實(shí)構(gòu)建成功。含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE證實(shí)表達(dá)的融合蛋白與理論預(yù)測的分子量相符，目的蛋白經(jīng)親和層析純化后獲得。
　　 ELISA檢測大鼠血清中抗體變化的趨勢，證實(shí)該重組蛋白能夠刺激大鼠產(chǎn)生特異性抗體，具有良好的免疫原性。
　　 Western Blotting鑒定蛋白免疫特性的結(jié)果表明，重組蛋白可分別被免疫大鼠血清、感染華支睪吸蟲的人血清識別，進(jìn)一步證實(shí)重組蛋

14、白能夠刺激大鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體，具有免疫原性。同時證實(shí)重組蛋白具有免疫反應(yīng)性，具有一定的免疫學(xué)價值。
　　 以重組蛋白CsMYND-ZF和成蟲粗抗原為包被抗原，應(yīng)用ELISA方法檢測30份華支睪吸蟲感染者、20份日本血吸蟲感染者和14份肺吸蟲感染者血清的總IgG。結(jié)果提示，CsMYND-ZF對華支睪吸蟲感染者血清的檢出率為33.3％；粗抗原的檢出率為83.3％，與日本血吸蟲和肺吸蟲感染者的血清均存在交叉反應(yīng)。

15、　　 3 CsMYND-ZF在華支睪吸蟲發(fā)育不同階段表達(dá)和定位的研究
　　 提取華支睪吸蟲囊蚴、蟲卵及成蟲的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA，采用RT-PCR對CsMYND-ZF編碼蛋白在發(fā)育不同時期的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，CsMYND-ZF基因在成蟲和囊蚴階段有表達(dá)，在蟲卵中沒有表達(dá)。
　　 以制備的抗rCsMYND-ZF大鼠血清為一抗，對華支睪吸蟲的成蟲、囊蚴石蠟組織切片進(jìn)行CsMYND-ZF的免疫組織化學(xué)定位。

16、結(jié)果提示，CsMYND-ZF主要定位在成蟲和囊蚴幼蟲的體表。
　　 4華支睪吸蟲MYND-ZF的細(xì)胞表達(dá)
　　 通過上述分子克隆技術(shù)將目的基因定向克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1中，經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定證實(shí)真核重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。pEGFP-N1-CsMYND-ZF轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，在顯微鏡下可觀察到綠色熒光分布于除細(xì)胞核以外的胞質(zhì)中，而48 h后胞質(zhì)中的熒光減弱，在部分細(xì)胞的細(xì)胞膜上可見稍強(qiáng)的綠色熒

17、光；而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞在24 h和48 h綠色熒光均勻分布于整個細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)檢測，在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞中CsMYND-ZF基因在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均有轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.從華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫中識別出了CsMYND-ZF基因，CsMYND-ZF全長1,440個核苷酸，編碼479個氨基酸，等電點(diǎn)和理論分子量分別是6.35和54.8kDa。拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析該蛋白含有一個跨膜區(qū)：S

18、102FPIYTLLYHELLVANLL119，N端位于膜內(nèi)(i)，C端位于膜外(o)。含有MYND結(jié)構(gòu)域。
　　 2.構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-28a(+)-CsMYND-ZF，大腸桿菌經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出重組融合蛋白，并純化得到了重組蛋白。ELISA顯示rCsMYND-ZF能夠刺激大鼠產(chǎn)生特異性抗體。Western Blotting結(jié)果表明rCsMYND-ZF具有較強(qiáng)的免疫原性和免疫反應(yīng)性。但診斷效果不佳。