華支睪吸蟲溶血磷脂酶基因（LysoPLA）的克隆表達及其功能的初步研究.pdf

1、研究目的華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)又稱肝吸蟲,成蟲寄生于肝膽管內,可引起華支睪吸蟲病(clonorchiasis),又稱肝吸蟲病.主要流行于東南亞地區(qū),全世界估計有2800萬病人.中國有華支睪吸蟲感染者近2000萬,廣東省為主要的高發(fā)區(qū),估計感染者約500萬人.該實驗從華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫中克隆出一個新基因--溶血磷脂酶基因(lysophospholipase,lysoPLA),溶血磷脂酶是一種作用于生物

2、膜上作為調節(jié)控制多功能溶血磷脂酸的酶,其作用主要是水解溶血磷脂酸,在宿主患病時能提高溶血磷脂酸的表達水平<'[2]>.而溶血磷脂酸在磷脂的新陳代謝中發(fā)揮著類除垢劑的作用,其在生理學上和病理學上發(fā)揮著重要的作用[1^4].該研究希望通過克隆表達溶血磷脂酶基因,并對其功能進行初步的研究,為研究華支睪吸蟲疫苗提供理論和實驗依據(jù).研究內容包括lysoPLA基因的克隆表達、蛋白免疫大白鼠后的免疫反應.方法①華支睪吸蟲lysoPLA基因的體外擴增、

3、克隆通過華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫篩選識別華支睪吸蟲新基因,以cDNA文庫為模板進行PCR擴增出lysoPLA基因的編碼區(qū)序列,1.0％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定.PCR產物、質粒pGEX-4T-1分別酶切、回收,后進行連接、轉化、初篩、PCR與酶切鑒定.②華支睪吸蟲lysoPLA基因的原核表達和純化利用IPTG誘導大腸桿菌表達出lysoPLA基因,經SDS-PAGE電泳鑒定表達產物,表達產物大小與預測結果相符,證實lysoPLA基因可以在原

4、核生物E. coli Bl-21中進行表達.③lysoPLA純化蛋白免疫大白鼠所誘導的免疫應答利用純化的蛋白,結合福氏佐劑對SD大白鼠進行蛋白免疫,在大鼠的腹部和大腿內側的皮內進行多點注射免疫.結論成功構建了含lysoPLA基因的原核表達重組質粒,并誘導表達出華支睪吸蟲的lysoPLA融合蛋白,在動物免疫中得到陽性結果,證明融合蛋白有抗原-抗體免疫反應性.有關溶血磷脂酶在華支睪吸蟲中的作用以及其在預防、治療華支睪吸蟲病的意義有待進一步的