重組鼠磷脂酶D2腺病毒的構建及其功能的初步研究.pdf

1、目的:構建含綠色熒光蛋白(GFP)的鼠磷脂酶D2野生型及其功能缺陷型的重組腺病毒顆粒；初步研究在產單核細胞李斯特菌刺激下細胞內PLD活性變化。 方法:將mPLD2基因及其功能缺陷點突變基因mPLD2(K758R)從真核表達載體pCGN中分別克隆至帶有GFP的穿梭載體中；再與腺病毒骨架載體一起在E.coliBJ5183中進行同源重組，構建含GFP的mPLD2及其功能缺陷型的重組腺病毒表達質粒；重組腺病毒質粒用脂質體轉染入293細胞

2、中進行包裝，產生重組mPLD2(野生型及其功能缺陷型)腺病毒顆粒；用該重組腺病毒感染293細胞，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光產生的情況，同時免疫印跡確證mPLD2蛋白在細胞內的表達。　　用重組腺病毒(野生型及其功能缺陷型)分別感染vero細胞，同時用空白腺病毒感染vero細胞作為對照，測定李斯特菌刺激后胞內PLD活性變化。 結果:獲得高滴度重組mPLD2腺病毒顆粒(野生型及其功能缺陷型)，病毒顆粒可有效感染293細胞，熒光顯微鏡

3、下監(jiān)測到大量發(fā)綠色熒光的細胞；抗體免疫印跡顯示，mPLD2蛋白在293細胞中有大量表達?！　PLD2蛋白、mPLD2(K758R)蛋白的過度表達對vero細胞內PLD基礎活性無影響；而用李斯特菌刺激后vero細胞內PLD活性較其基礎活性均有明顯的增強(p＜0.001)；在李斯特菌刺激組中，mPLD2蛋白的過度表達與感染空白腺病毒的對照相比使細胞內PLD活性增強約45％(p＜0.01)，mPLD2(K758R)蛋白的過度表達使其活性降