重組磷脂酶C的制備、酶學(xué)性質(zhì)及其mPEG修飾初探.pdf

1、磷脂酶C（Phospholipase C，PLC，EC3.1.4.3）是一種專一水解甘油磷脂C3鍵的水解酶，其水解產(chǎn)物為磷酸單脂和二酰甘油，普遍存在于原核及真核生物中。磷脂酶C廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及酶法脫膠等領(lǐng)域。產(chǎn)磷脂酶C的微生物種類較多，易于大規(guī)模生產(chǎn)，因此源自微生物的磷脂酶C已成為工業(yè)用酶的最主要來源。本研究篩選出一株高產(chǎn)磷脂酶C菌株，對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，制備了具有活性的大腸桿菌重組磷脂酶C并對(duì)該酶的性質(zhì)及其mPEG修飾進(jìn)行了

2、研究，以期獲得活性高且熱穩(wěn)定較好的磷脂酶C。主要研究結(jié)果如下：
　　1.運(yùn)用卵黃平板法從廈門集美紅樹林泥樣中分離出11株產(chǎn)磷脂酶C菌株，其中一株菌生產(chǎn)的磷脂酶C具有較高的酶活性和溶血活性，命名為HSL3。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列分析，最終鑒定該菌株為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。通過單因素試驗(yàn)對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示：在25℃，裝液量75 mL/250 mL，pH7.0，卵黃添加量1

3、％，接種量0.25%條件下培養(yǎng)24h，酶活力達(dá)到22.8 U/mL，較優(yōu)化前提高了30.46%。
　　2.以HSL3菌株基因組為模板克隆了其磷脂酶C基因，成功構(gòu)建了E. coliEr2566/pSmart I-PLC融合表達(dá)菌株。在25℃誘導(dǎo)5h獲得有活性的重組磷脂酶C（SUMO-PLC）。切除SUMO標(biāo)簽后，SDS-PAGE顯示異源表達(dá)的磷脂酶C分子量約為28 KDa，通過LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定其為磷脂酶C。
　　3.重

4、組磷脂酶C的酶學(xué)特性：該酶的最適反應(yīng)溫度為80℃，60℃保溫50 min仍具有85%的酶活，70℃保溫50 min剩余63%酶活，熱穩(wěn)定性良好；最適作用pH為8.0，在pH7.2~8.0范圍內(nèi)其穩(wěn)定性較好；可被Zn2+、Mn2+激活，而Cu2+則抑制其活性，EDTA可強(qiáng)烈抑制該酶活性，EGTA對(duì)該酶酶活有一定的影響；該酶具有廣泛的底物特異性，可以水解磷脂酰膽堿（PC），磷脂酰甘油（PG），磷脂酰絲氨酸（PS）及磷脂酰肌醇（PI），但不能

5、水解鞘磷脂（SM）；對(duì)磷脂酰膽堿的Km和Vmax值分別為0.27 mM和131.57mM min-1， Kcat值為89.5 s-1。
　　4.運(yùn)用化學(xué)修飾劑mPEG琥珀酰亞胺酸酯對(duì)重組磷脂酶 C進(jìn)行化學(xué)修飾。在修飾劑與磷脂酶C的摩爾比為10，20，30時(shí)，修飾率分別為10.68%，15.85%和19.98%。對(duì)修飾后的酶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定及分子量測(cè)定，確定修飾后的重組磷脂酶C分子量為33 KDa，比未修飾酶大5 KDa。修飾酶的最適反

6、應(yīng)溫度和最適pH沒有發(fā)生改變，但是熱穩(wěn)定性和pH耐受性均有所提高。在修飾率為10.68%時(shí)酶活及穩(wěn)定性最好，其剩余酶活為92.87%，在70℃保溫50 min剩余酶活由63.20%提高到70.24%，80℃時(shí)剩余酶活由7.40%提高到10.80%，對(duì)修飾率為10.68%的SS-mPEG-PLC進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，得到其對(duì)磷脂酰膽堿的Km和Vmax分別為0.62 mM和222mM/min，Kcat值為622.89s-1，該酶在4℃的貯藏穩(wěn)定性