華支睪吸蟲特異性多表位復(fù)合抗原基因的構(gòu)建、克隆表達及重組蛋白的抗原性分析.pdf

1、華支睪吸蟲病(clonorchiasis)又稱肝吸蟲病，是由華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)感染引起的一種人獸共患病，也是我國常見的食源性寄生蟲病。華支睪吸蟲病廣泛流行于東亞地區(qū)和我國大部分地區(qū)，以廣東省流行最為嚴重。全國現(xiàn)有肝吸蟲感染者1249萬，其中廣東省占500多萬。廣東省有81個縣市流行肝吸蟲病，珠江三角洲地區(qū)流行最為嚴重，個別地區(qū)人群感染率高達85％，并呈逐漸上升的趨勢。華支睪吸蟲病由寄生于人體肝膽管內(nèi)的華

2、支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)引起，可產(chǎn)生嚴重的肝膽并發(fā)癥，與膽管癌的關(guān)系也非常密切。 華支睪吸蟲成蟲可長期寄生于人的肝膽管內(nèi)，對肝膽系統(tǒng)造成慢性損傷，引起膽管局限性擴張、膽管炎、膽管上皮細胞腺瘤樣增生、肝硬化甚至誘發(fā)肝膽管腫瘤，是廣東省重點防治的地方病之一。作為我國最重要的食源性寄生蟲病，引起了國家的高度重視，被列為國家重點防治的目標(biāo)疾病之一。 華支睪吸蟲病的正確診斷是防治的關(guān)鍵。華支睪吸蟲病的實驗

3、室診斷主要包括病原學(xué)方法和免疫學(xué)方法。目前華支睪吸蟲病的診斷主要依靠病原學(xué)檢查和免疫學(xué)檢測，兩種檢查方法各有其利弊。病原學(xué)檢查以糞便鏡檢蟲卵為主要方法。由于在人體內(nèi)寄生的蟲數(shù)一般不多，排卵數(shù)量較少，蟲卵形態(tài)又非常小，該法極易漏診，且操作費時費力，不適合大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。 免疫學(xué)診斷技術(shù)因其具有較高的敏感性和特異性，操作簡便易行，近年來已成為華支睪吸蟲病的最常用的輔助診斷手段，在臨床輔助診斷和流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)揮了越來越重要的作

4、用。目前，華支睪吸蟲病免疫學(xué)診斷方法分為檢測抗原和檢測抗體兩大類，后者較為穩(wěn)定、可靠，檢出率高，使用較為普遍，其中尤以檢測血清中特異性抗體的ELISA以及基于ELISA的改進方法最為常見。 ELISA方法具有高度的敏感性和特異性，操作簡便，無需特殊儀器設(shè)備，血樣用量少，結(jié)果容易判斷，適合現(xiàn)場應(yīng)用，是目前流行病調(diào)查和臨床診斷中應(yīng)用最為廣泛的免疫診斷方法。 用于抗體檢測的診斷抗原直接影響著檢測的效果，包括檢測的敏感性和特異性。因此，

5、一直成為免疫學(xué)診斷的研究重點。目前用于華支睪吸蟲病診斷的ELISA檢測試劑盒所使用的抗原包括成蟲粗抗原、蟲體分泌、排泄抗原等，但這些復(fù)合抗原存在假陰性和假陽性率都比較高，且抗原的來源困難和難以標(biāo)準化的問題。因此，應(yīng)用成分明確的重組抗原替代粗抗原是免疫診斷試劑盒研制的必然趨勢。關(guān)于華支睪吸蟲免疫診斷抗原的篩選和評價是國內(nèi)外華支睪吸蟲病研究的重點，也是本實驗室近年來對華支睪吸蟲研究的主要目標(biāo)之一。 本實驗室近年來一直致力于華支睪吸蟲

6、的研究，也已發(fā)現(xiàn)鑒定了一批華支睪吸蟲的基因，鑒于目前免疫診斷上假陰性和假陽性率均較高的問題，我們設(shè)想，如果借助生物信息學(xué)的方法將許多華支睪吸蟲基因中的特異性抗原表位組合在一起，形成一個新的多抗原表位復(fù)合物，是否可以同時解決假陰性和假陽性率均較高的問題。 研究目的： 利用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)華支睪吸蟲特異性的抗原表位，人工構(gòu)建華支睪吸蟲特異性多表位復(fù)合抗原基因，并通過基因工程技術(shù)進行克隆和表達，制備重組抗原，分析其抗原性。

7、 研究方法： 1、華支睪吸蟲多基因的生物信息學(xué)分析、特異性表位的選取及合成 用PCGENE及BLASTX方法從本室已克隆表達的18個華支睪吸蟲基因中選擇出18個華支睪吸蟲特異性抗原表位，運用Overlapping PCR技術(shù)合成多表位的編碼基因MSE(multiple-specific-epitope)。 2、MSE基因的育隆、表達及純化 將MSE基因先后克隆到pET30a和pGEX-4T-1表達載

8、體中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別經(jīng)PCR、雙酶切及測序進行鑒定。后將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL-21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE分析表達情況，親和層析純化目的蛋白。 3、Western blotting分析MSE的抗原反應(yīng)性 將MSE抗原通過Western blotting方法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用華支睪吸蟲感染大鼠的陽性血清及未被華支睪吸蟲感染的大鼠陰性血清和膜共孵育，觀察MSE的抗原反應(yīng)性。 研

9、究結(jié)果： 1、華支睪吸蟲多基因的生物信息學(xué)分析、特異性表位的選取及合成 用PCGENE及BLASTX方法從本室已克隆表達的18個華支睪吸蟲基因中選擇出18個華支睪吸蟲特異性抗原表位，DNEKFD、DDDEDRER、DDKYDER、DDSQKK、KLEEERRL、KKDPAR、ELRDDNGND、SMDDRKTTR、NDELEK、EKPPEERR、RSRDES、SESHRR、KDSHPDEE、KGERTK、ETEGRKRM

10、VR、RDLTER、DKTDEELKR、DADNRE，我們?nèi)斯ぴO(shè)計了12條引物，通過Overlapping PCR技術(shù)將編碼這些特異性抗原表位的序列串聯(lián)組合在一起，形成編碼MSE蛋白的序列。合成序列經(jīng)測序證實構(gòu)建成功。 2、MSE基因的克隆、表達及純化 將MSE基因先后定向克隆到pET30a和pGEX-4T-1表達載體中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別經(jīng)PCR、雙酶切及測序進行鑒定。后將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL-21(DE3

11、)，IPTG誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE分析表達情況，pET30a重組質(zhì)粒未見預(yù)期的融合蛋白表達，pGEX-4T-1質(zhì)粒的菌株誘導(dǎo)表達后可見大小為46kDa的蛋白特異性表達，與預(yù)期的融合蛋白分子量一致。該融合蛋白以上清形式表達，沉淀中幾乎無誘導(dǎo)表達的融合蛋白。用GST親和層析柱純化目的蛋白成功。 3、Western blotting分析MSE的抗原反應(yīng)性 MSE在pGEX-4T-1載體中能與GST標(biāo)簽一起形成GST-MSE

12、融合蛋白，該蛋白可溶性表達，但經(jīng)凝血酶酶切后MSE易降解，故只能以GST-MSE融合蛋白形式研究其免疫學(xué)性質(zhì)。經(jīng)純化后Western blotting檢測，顯示此重組蛋白能與抗GST單抗血清及華支睪吸蟲感染的大鼠陽性血清發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，不能與陰性的大鼠血清反應(yīng)。 研究結(jié)論： 該多表位重組蛋白MSE為高度親水性的蛋白，理化性質(zhì)很不穩(wěn)定，溶液中極易降解；GST伴侶蛋白可以提高其穩(wěn)定性，融合重組蛋白GST-MSE具有抗原性，