丙型肝炎病毒不同基因型不同區(qū)域重組蛋白的抗原性分析及應(yīng)用.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV)所致的丙型肝炎(HC)是一種危害嚴(yán)重的傳染病,本研究中我們構(gòu)建了分別含有HCV不同基因型不同編碼區(qū)片段基因的重組質(zhì)粒,分別表達(dá)純化了相應(yīng)的目的蛋白,旨在探討不同編碼區(qū)不同基因序列對(duì)重組蛋白抗原反應(yīng)性的影響以及在HCV抗體檢測(cè)中的意義.本研究分為三部分:一、HCV不同基因型不同區(qū)域重組質(zhì)粒的構(gòu)建、蛋白表達(dá)及純化分別從含有HCV各片段基因的質(zhì)粒上以PCR擴(kuò)增出位于HCV C、NS3(1型)、NS3(6型)和NS5區(qū)的基

2、因片段;雙酶切后插入pET-28a-c(+)載體;隨后4種重組質(zhì)粒分別先后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α和BL21;鑒定正確后在1mmol/L IPTG的誘導(dǎo)下分別表達(dá)4種重組蛋白;應(yīng)用親和層析法分別純化獲得各目的蛋白,蛋白凝膠電泳初步鑒定.二、HCV不同基因型不同區(qū)域重組蛋白的抗原性分析分別以5種HCV單片段抗原(C、NS3 1型、NS3 6型、NS4或NS5)檢測(cè)90份抗-HCV抗體陽性血清和126份大學(xué)生體檢血清以及39份陰性質(zhì)控血清;結(jié)果

3、90份陽性血清中共有83份可與一種或多種單片段抗原反應(yīng),陽性率分別為86.7％(C)、73.5％(NS3 1型)、71.1％(NS3 6型)、60.2％(NS4)和50.0％(NS5),其中有7份標(biāo)本以NS3-1型抗原檢測(cè)陰性,但可被NS3-6型抗原檢出,反之,有9份血清以NS3-6型重組蛋白檢測(cè)為陰性,而NS3-1型檢測(cè)陽性;僅與C、NS3、NS4和NS5一種抗原發(fā)生反應(yīng)的分別有7份、3份、2份和3份血清標(biāo)本,126份大學(xué)生體檢血清和

4、39份陰性質(zhì)控血清經(jīng)各單片段抗原檢測(cè)均陰性;結(jié)果顯示從HCV不同基因序列來源的不同基因區(qū)域的片段重組抗原的免疫反應(yīng)有所差別,所以在發(fā)展HCV抗體檢測(cè)試劑時(shí)應(yīng)考慮這一點(diǎn).三、抗-HCV抗體ELISA一步法的建立及應(yīng)用我們?cè)诜治隽薍CV不同序列不同區(qū)域重組蛋白抗原性差別的基礎(chǔ)上,建立了含有5種單片段蛋白混合抗原的ELISA一步法檢測(cè)抗-HCV并進(jìn)行了相關(guān)試驗(yàn);結(jié)果90份抗-HCV陽性血清有83份被混合抗原檢測(cè)出,其中有16份經(jīng)PCR檢測(cè)為陽

5、性的標(biāo)本用本方法檢測(cè)也全部陽性,126份大學(xué)生體檢血清和39份陰性質(zhì)控血清經(jīng)混合抗原檢測(cè)均陰性,穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示該檢測(cè)試劑在4℃可以至少保存6個(gè)月,重復(fù)性試驗(yàn)顯示其變異系數(shù)在10％以內(nèi);結(jié)果表明建立的抗-HCV抗體ELISA一步法檢測(cè)試劑具有方便、快速等特點(diǎn).綜上所述,HCV不同基因型不同基因區(qū)域編碼的片段重組抗原的抗原性有所差別,HCV序列的高度異質(zhì)性對(duì)于重組蛋白的抗原性有重要影響;所以在發(fā)展HCV的診斷試劑時(shí),應(yīng)該對(duì)HCV抗原大量篩選