幽門(mén)螺桿菌CagA和VacA重組蛋白的表達(dá)、純化及抗原性檢測(cè).pdf

1、目的:構(gòu)建幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(Cytotoxin associated gene A,CagA)和空泡細(xì)胞毒素(Vacuolating cytotoxin A,VacA)的重組質(zhì)粒,并在大腸桿菌中表達(dá)獲得基因重組蛋白,為檢出幽門(mén)螺桿菌致病株和運(yùn)用于臨床檢測(cè)Hp的感染奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:挑選CagA基因和VacA基因的優(yōu)勢(shì)抗原表位片段,收集H.pylori標(biāo)準(zhǔn)株NCTC

2、11639,提取基因組DNA,PCR擴(kuò)增目的基因片斷,將其分別克隆到克隆載體pGEM-T和pMD18-T載體并測(cè)序,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T／CagA和pMD18-T／VacA,將鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,把目的基因克隆入表達(dá)載體pET-16b,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET16b／CagA與pET16b／VacA。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E Coli Rosetta后誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE鑒定、鎳親和層析純化,并透析復(fù)性后,ELISA法檢測(cè)重

3、組蛋白CagA、VacA的免疫原性。
　　 結(jié)果:PCR擴(kuò)增結(jié)果表明分別得到了大小約為1962bp和2256bp的目的片段:構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序證明其中插入片段分別為CagA和VacA的目的基因,測(cè)序結(jié)果與Genbank上登錄序列比對(duì)后,結(jié)果完全一致:SDS-PAGE分析顯示,在IPTG誘導(dǎo)下,重組工程菌表達(dá)了一相對(duì)分子量(Mr)約為75KDa和87KDa的目的蛋白條帶,表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的20％,鎳親和層析純化率約9

4、0％；目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)主要以可溶性蛋白和包涵體形式存在,經(jīng)間接ELISA法檢測(cè)重組蛋白CagA、VacA具有一定免疫原性。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了pET16b／CagA、pET16b／VacA2個(gè)原核表達(dá)重組體,將其分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后,分別表達(dá)出了相對(duì)分子量(Mr)約為75KDa租87KDa的CagA和VacA重組蛋白,間接ELISA法檢測(cè)重組蛋白CagA、VacA具有較好的免疫反應(yīng)性,其中CagA蛋白的免疫反應(yīng)性較Vac