幽門螺桿菌CagA、VacA及外膜蛋白HomA、HomB多態(tài)性與疾病的關系.pdf

1、研究背景與目的:
　　幽門螺桿菌(H.pylori)感染的結局是多樣性的,可以是無癥狀細菌攜帶,也可以引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜相關淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤。H.pylori感染后的結局主要受細菌、宿主和環(huán)境因素三者的影響,其中細菌因素起重要作用,而H.pylori致病因子基因多態(tài)性是其重要原因。H.pylori的細胞毒素相關蛋白基因(cagA)及空泡毒素相關基因(vacA)是H.pylori兩個最重要的致病毒力因

2、子,近年研究發(fā)現(xiàn)H.pylori的外膜蛋白homB在其致病中也起重要作用。在我國大部分H.pylori菌株都帶有vacA和cagA基因,因此無法單純地用它們的表達來確定其毒力作用及其和疾病的相關性。近年研究表明vacA基因信號區(qū)、開碼讀框的中間區(qū)和基因的中間區(qū)域的基因多態(tài)性,以及CagA EPIYA基序的多態(tài)性與疾病的轉歸有關。國外學者研究表明HomA和HomB參與了H.pylori的致病,但所得結果不一致,這可能與它們的基因多態(tài)性和地

3、域差異有關。本文觀察了來自不同疾病的170株臨床分離的H. pylori菌株的cagA、vacA、homA和homB基因的表達,并同時進行了vacA分型,CagA的EPIYA基序分型和homB基因的全長測序,以期分析這三個基因及它們的基因多態(tài)性與疾病的關系。
　　方法:
　　1.H.pylori外膜蛋白HomA及HomB的基因檢測:
　　(1)對前期分離的170株臨床H.pylori菌株進行復蘇培養(yǎng),并提取其基因組DN

4、A;
　　(2)對提取的基因組DNA進行稀釋,以備后用;
　　(3)對homA和homB基因中間區(qū)域的差異片段進行引物設計,從而可以檢測出表達homA和homB的菌株;
　　(4)進行PCR擴增,在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)homB161bp,homA128bp的兩個條帶,分別得到表達homA和homB的菌株。
　　2. H.pylori外膜蛋白HomB基因序列特征及CagA(EPIYA)、VacA(s/i/m)基因分

5、析
　　(1)針對H.pylori外膜蛋白HomB、CagA(EPIYA)及VacA(s/i/m)基因序列合成多對特異性測序引物;
　　(2)對目的基因進行擴增,并將其產物送華大基因公司測序;
　　(3)得到homB和CagA(EPIYA)的測序結果,以及VacA(s/i/m)分型結果,利用生物信息學軟件—Primer5.0、MEGA、AlignX,及相關信息數(shù)據(jù)庫進行DNA序列和氨基酸序列比對,分析外膜蛋白HomB以

6、及兩種毒力基因的多態(tài)性與臨床疾病、病理之間的聯(lián)系。
　　3.統(tǒng)計學處理
　　計數(shù)資料采用卡方檢驗或Fisher確切概率法進行處理,應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析,p<0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.CagA羧基端可變區(qū)(EPIYA)氨基酸序列的特征分析:
　　在來自臨床分離的H.pylori170株中,100％表達cagA基因。通過測序得到cagA3′端可變區(qū)序列全長,其DNA序列翻譯為氨

7、基酸后CagA的C端可變區(qū)起始于5個或6個多聚天門冬氨酸NNNNNN,終止于LSKVG序列。其EPIYA基序數(shù)量為0~4個:4株含有4個EPIYA基序,其中兩株為胃癌株;2株含有2個EPIYA基序的均為慢性胃炎株;3株EPIYA基序缺失的突變株;161株3個EPIYA基序的菌株無明顯的疾病相關性。所有 H.pylori菌株可分為三種序列型—即含有2個EPIYA基序的AB型、含有3個EPIYA基序的ABD型和含有4個EPIYA基序的AAB

8、D型,均為東方型(TIDD)。
　　進一步分析EPIYA基序中的多態(tài)性發(fā)現(xiàn):2株EPIYA-A突變的H.pylori均來自慢性胃炎患者,而9株EPIYA-B突變的H.pylori菌中的2株來自胃癌患者,7株來自十二指腸潰瘍患者,表明EPIYA-B突變株致病性更強。
　　2. vacA基因分型:
　　對170株H.pylori vacA基因進行PCR擴增,除第152株菌i1、i2不表達外,其余菌株均為s1a/m2/i1型

9、,與疾病無相關性。由于vacA基因分型是:s1型有毒力、s2型沒有毒力,同樣的m1型的毒力強于m2型,i1型有毒力而i2型弱或無毒力。提示江西地區(qū)的菌株,其vacA的基因型較為保守,表達集中,且大部分均為中等強度毒力菌株,它們導致不同的疾病可能是多個毒力因子共同作用所致。
　　3.H.pylori外膜蛋白HomA和HomB基因的表達:
　　(1) homA和homB在臨床疾病中的分布
　?、僭趤碜耘R床分離的H.pylo

10、ri170株中,其中27株來自胃癌、20株來自胃潰瘍、75株來自十二指腸潰瘍、48來自株胃炎;
　?、趆omA單陽性率為14.7%(25/170),其在胃癌、胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃炎的陽性率分別為22.2%(6/27)、20.0%(4/20)、13.3%(10/75)、10.4%(5/48),各組間無顯著差異(p>0.05);
　?、踙omB單陽性率為70%(119/170),其在胃癌、胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃炎的陽性率分

11、別為74.1%(20/27)、75.0%(15/20)、68.0%(51/75)、68.8%(33/48),各組間無顯著差異(p>0.05);
　　④homA和homB雙陽性率為15.3%(26/170),其在胃癌、胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃炎的陽性率分別為3.7%(1/27)、5.0%(1/20)、18.7%(14/75)、20.8%(10/48),其中胃癌組與胃炎組中表達有統(tǒng)計學差異(p=0.044),其余各組間無顯著差異。

12、r>　　(2)homA和homB在臨床病理中的分布
　?、僭趤碜耘R床分離的H.pylori170株中,其中90株(十二指腸潰瘍者及5株慢性胃炎患者未進行病理學檢查)有臨床病理檢測結果、42株為慢性淺表性胃炎、21株為腸上皮化生(腸化)和不典型增生、27株為胃癌;
　?、趆omA單陽性率為14.4%(13/90),其在慢性淺表性胃炎、腸化和不典型增生、胃癌的陽性率分別為9.5%(4/42)、4.3%(3/21)、22.2%(6

13、/27),各組間(p>0.05)無顯著差異;
　?、踙omB單陽性率為68.9%(62/90),其在慢性淺表性胃炎、腸化和不典型增生、胃癌的陽性率分別為64.3%(27/42)、71.4%(15/21)、74.1%(20/27),各組間(p>0.05)無顯著差異;
　?、躧omA和 homB雙陽性率為16.7%(15/90),其在慢性淺表性胃炎、腸化和不典型增生、胃癌中的陽性率分別為26.2%(11/42)、14.3%(3/

14、21)、3.7%(1/27),homA和homB雙陽性在三種病理中表達有統(tǒng)計學差異(p=0.047),同時在胃癌組與慢性淺表性胃炎組中表達也有統(tǒng)計學差異(p=0.016),其余各組間無顯著差異。
　　4.homB基因測序與比對分析
　　homB基因陽性的145株中,經過3次優(yōu)化條件的PCR和測序,最終僅獲得了59株菌的完整全長序列。其中胃癌株的測序成功率(9.5%)顯著低于其它3組(50.0%~66.7%)(p<0.05)。

15、基因測序失敗的原因目前認為主要是因為基因序列本身的高級結構、重復序列以及高GC含量等,導致測序時出現(xiàn)結合、雜合等所致,而胃癌株測序成功率低,提示其高級結構復雜或重復序列多,這可能是胃癌株毒力較強的原因之一。
　　將這些序列利用MEGA和AlignX等生物信息學軟件逐個進行校對后再與標準序列進行分析比對發(fā)現(xiàn)homB整個基因序列的變化很大,且100~1600位點上基因多態(tài)性較強,后半部分變化比較小,但整個序列的保守性較差。這59株H.

16、pylori的homB基因序列無明顯的疾病聚集性,這可能是因為結構復雜和多態(tài)性強的菌株未能成功測序所致。
　　將江西地區(qū)的homB基因與國外的14株標準菌株的homB基因輸入MEGA軟件進行比對和聚類分析,發(fā)現(xiàn)突變廣泛存在于不同區(qū)域的菌株中;東西方國家標準菌株之間存在較大差異性;江西地區(qū)菌株與東亞國家(日本,韓國)標準菌株之間也存在較大差異性。同時江西地區(qū)的菌株以及日本和韓國國內的標準菌株均無明顯的地區(qū)聚集性,并且西方國家的標準菌

17、株分布更為離散。
　　結論:
　　1.江西地區(qū)cagA基因的陽性率為100%,明顯高于其他地區(qū),且cagA基因均為東亞型。
　　2.H.pylori的致病性會隨著CagA EPIYA基序數(shù)量的增加而增強,EPIYA-B突變的致病性強于EPIYA-A突變株和無突變株。
　　3.江西地區(qū)的vacA基因,除一株菌i型無表達外,其余均為s1a/m2/i1型,且不同疾病中其毒力也無明顯差異。
　　4.江西地區(qū)的H.p