幽門螺桿菌融合蛋白VacA-HpaA卵黃抗體的制備及體外試驗(yàn).pdf

1、第一部分幽門螺桿菌融合蛋白VacA—HpaA 卵黃抗體的制備 目的：采用基因工程技術(shù)大量表達(dá)幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H．pylori)細(xì)胞空泡毒素(vacuolatingcytotoxinantigenA，VacA)與粘附素(HelicobacterpyloriadhesinA，HpaA)的融合蛋白(VacA-HpaA)，鑒定其抗原性與免疫原性后，以此融合蛋白作為抗原，制備高效價(jià)的VacA-Hp

2、aAIgY。 方法：通過大量培養(yǎng)重組菌pQE30-VacA-HpaA-DHsa，誘導(dǎo)表達(dá)獲得融合蛋白VacA-HpaANi2+_NTA樹脂純化。用Westernblot鑒定融合蛋白VacA-HpaA對(duì)VacA和HpaA的抗原特異性，用融合蛋白免疫兔，獲得多克隆抗血清，采用間接ELISA法檢測(cè)其分別針對(duì)VacA和HpaA的免疫原性。將純化的融合蛋白免疫雞，水稀釋結(jié)合氯仿有機(jī)沉淀法提取IgY。ELISA法測(cè)定抗體產(chǎn)生的時(shí)間一效價(jià)變化

3、。硫酸銨沉淀法純化濃縮VacA-HpaAIgY，SDS-PAGE分析純度，Bradford法測(cè)定蛋白含量，Westernblot檢測(cè)其分別對(duì)VacA和HpaA的特異抗原性，E．ISA法檢測(cè)效價(jià)。 結(jié)果：1．目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，經(jīng)NI2+—NTA柱純化，可獲得純度為30％以上的融合蛋白，Bradford法測(cè)得蛋白質(zhì)含量為0．72mg／ml；分別具有VacA和HpaA的抗原性和免疫原性；2．融合蛋白免疫雞后的蛋黃提取物可與

4、該蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)；3．IgY效價(jià)總體上隨免疫時(shí)間增加而升高。4．獲得的VacA-HpaAIgY經(jīng)純化濃縮后，純度為60％左右，效價(jià)為1：12800，蛋白濃度為22mg/ml，5．Westernblot顯示在27000和30000處分別有相應(yīng)條帶，顯示其對(duì)VacA和HpaA有相應(yīng)抗原性。6．VacA-HpaAIgY能與VacA和HpaA反應(yīng)，效價(jià)可達(dá)1：3200和1：6400。 結(jié)論：表達(dá)的VacA-HpaA融合蛋白分別對(duì)Vac

5、A和HpaA均具有良好的抗原性和免疫原性；成功制備了高濃度、較高效價(jià)的融合蛋白雞卵黃抗體(VacA-HpaAIgY)，該IgY能與VacA和HpaA發(fā)生特異性反應(yīng)，為進(jìn)一步研究其理化性質(zhì)和生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。第二部分幽門螺桿菌融合蛋白VacA-HpaA 卵黃抗體的體外研究 目的：研究VacA-HpaA融合蛋白的雞卵黃抗體(IgY)的理化特性和生物學(xué)活性，評(píng)價(jià)其抗H．pylori感染的可行性，為制備集預(yù)防與治療為一體的

6、抗H．pylori感染的制劑奠定基礎(chǔ)。 方法：1、檢測(cè)VacA-HpaAIgY的耐熱性、耐酸性及其對(duì)酶消化的耐受作用2、將VacA-HpaAIgY與純培養(yǎng)的H．pylori混合孵育，觀察不同濃度IgY的抑菌作用；3、用MTT法檢測(cè)不同濃度VacA-HpaAIgY對(duì)細(xì)胞毒活性的中和作用；4、用TUNEL法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)VacA-HpaAIgY對(duì)菌體蛋白致凋亡的細(xì)胞毒活性的中和保護(hù)作用；5．用掃描電鏡觀察VacA-HpaAIgY

7、對(duì)AGS細(xì)胞粘附的中和作用。 結(jié)果：1、該IgY抗體經(jīng)巴氏消毒后抗體活性不丟失；具有一定的耐酸性，在pH>4時(shí)，抗體活性較穩(wěn)定，在pH<4后，抗體活性下降很快；對(duì)胃蛋白酶有一定的耐受性；2、該IgY抗體對(duì)H．pylori菌的生長具有濃度依賴性和pH依賴性抑菌作用；3、vacA--hpaAIgY對(duì)細(xì)胞毒活性有中和作用，且具有量效性和時(shí)效性；4、IgY抗體濃度依賴性地阻斷H．pylori菌體蛋白的致細(xì)胞凋亡毒活性；5、IgY抗體可阻