幽門螺桿菌重組NapA蛋黃抗體的制備和體內(nèi)外研究.pdf

1、第一部分：幽門螺桿菌NapA-CtxB融合蛋白的基因克隆與表達(dá)目的：采用基因工程技術(shù)克隆、表達(dá)幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H．pylori)中性粒細(xì)胞激活蛋白NapA與霍亂毒素B亞單位ctxB融合基因NapA-ctxB，為研制H．pylori疫苗提供有效抗原，為探討NapA致病機(jī)理、制備預(yù)防H．pylori感染的疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法：用PCR方法擴(kuò)增ctxg目的基因片段，克隆至pQE30-NapA質(zhì)粒的Na

2、pA基因上游，構(gòu)建含雙基因的表達(dá)質(zhì)粒pQE-nctB，轉(zhuǎn)化E．coliDH5a，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白NCTB；Westernblot分析其抗原性。 結(jié)果：經(jīng)測(cè)序HCTB融合基因片段由807bp組成，編碼269個(gè)氨基酸殘基的多肽。經(jīng)SDS-PAGE分析相對(duì)分子量(Mr)約為30000?？扇苄员磉_(dá)占全菌的27％以上，經(jīng)親和層析后可獲得純度為94％以上的重組蛋白。Westernblot分析顯示能分別與NpaA抗血清和CT抗血清反

3、應(yīng)。 結(jié)論：NapA和ctxB融合基因原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，并在大腸桿菌DH5a中高效的表達(dá)。 第二部分：幽門螺桿菌重組NapA-IgY和NapA-CtxB-IgY的制備 目的：以重組幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(NapA)和NapA-CtxB為抗原，制備高效價(jià)的抗NapA蛋黃抗體(IgY)和抗NCTB蛋黃抗體(IgY)，為研制幽門螺桿菌治療、預(yù)防性抗體奠定基礎(chǔ)。 方法：以制備的重組蛋白免疫雞，水稀釋結(jié)合

4、氯仿有機(jī)沉淀法提取IgY。ELISA法測(cè)定抗體產(chǎn)生的時(shí)間一效價(jià)變化。將效價(jià)高的NapA—IgY和NCTB-IgY分別混合，硫酸銨沉淀法純化濃縮，間接ELISA法測(cè)定效價(jià)，Bradford法測(cè)定蛋白含量。Westemblot檢測(cè)制備的NapA-IgY和NapA-CtxB-IgY的抗體活性。 結(jié)果：Nap重組蛋白和NCTB融合蛋白免疫雞后的蛋黃提取物可與該蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，IgY效價(jià)隨免疫時(shí)間增加而升高。經(jīng)純化濃縮后，NapA-Ig

5、Y的效價(jià)為l：12800，蛋白濃度為23．67mg／ml；NapA-CtxB-IgY的效價(jià)為1：25600蛋白濃度為30．02mg／ml。 結(jié)論：成功制備了高濃度、高效價(jià)的NapA-IgY和NapA-CtxB-IgY。 第三部分：重組NapA卵黃抗體抗幽門螺桿菌感染的體外研究 目的：探討重組NapA的雞蛋黃抗體(NapA-IgY)抑制H．pylori對(duì)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS細(xì)胞的黏附作用，評(píng)價(jià)其抗H．pylori感染的

6、可行性，為制備抗H．pylori感染的預(yù)防性制劑奠定基礎(chǔ)。 方法：設(shè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，然后把胃癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞以1×106／ml的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,48h后，當(dāng)細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中先加入1ml濃度為0．5mg／ml的NapA-IgY，半小時(shí)后加入lml濃度1×108CFU／ml的H．pylori菌液，繼續(xù)孵育4小時(shí)后，采用掃描電鏡(SEM)觀察H．pylori對(duì)AGS細(xì)胞的粘附情況。對(duì)照組的AGS細(xì)胞不加入Na

7、pA—IgY，半小時(shí)后直接加入lml細(xì)菌1×108CFU／ml的H．pylori菌液?？瞻捉M的AGS細(xì)胞既不加H．pylori菌液，也不加NapA—IgY。結(jié)果：4個(gè)小時(shí)后，掃描電鏡(SEM)下可見空白組AGS細(xì)胞周圍基本沒有H．pylori粘附，實(shí)驗(yàn)組AGS細(xì)胞周圍粘附H．pylori較少，對(duì)照組AGS細(xì)胞周圍粘附有大量的H．pylori。 結(jié)論：重組Nap的雞蛋黃抗體(NapA-IgY)能抑制H．pylori對(duì)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)G

8、S細(xì)胞的黏附，有阻止H．pylori定植的作用?？捎糜谥苽漕A(yù)防H．pylori感染的制劑。 第四部分：重組NapA卵黃抗體抗幽門螺桿菌感染的體內(nèi)研究 目的：通過小鼠口服NapA-IgY進(jìn)行預(yù)防H．pylori的感染，評(píng)價(jià)其抗H．pylori感染的可行性，為制備抗H．pylori感染的預(yù)防性IgY制劑奠定基礎(chǔ)。 方法：按照口服NapA-IgY制劑量的大小將BALB／~小鼠隨機(jī)分成四組(1mg／ml；100ug／ml

9、；60ug／ml；30ug／m1)，同時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照組(幽門螺桿菌感染組)和陰性對(duì)照組(腦心浸液灌胃)。將NapA-IgY以間隔2天，分三次的方法口服灌胃BALB／c小鼠，2、4、6周后分批處死BALB／c小鼠，然后進(jìn)行細(xì)菌的定量培養(yǎng)，快速尿素酶實(shí)驗(yàn)，常規(guī)HE染色后對(duì)胃炎進(jìn)行分級(jí)。 結(jié)果：H．pylori感染組的總感染率為70％，當(dāng)NapA-IgY抗體制劑量為30ug／ml時(shí)就可以達(dá)到效理想的預(yù)防作用。 結(jié)論：成功建立幽