重組幽門螺桿菌口服脂質體疫苗的制備及其免疫保護作用的基礎研究.pdf

1、該研究的目的是:選擇Hp尿素酶B亞單位(UreB)和過氧化氫酶(Kat)為靶抗原,應用基因工程技術分別構建重組UreB(rUreB)和重組Kat(rKat)原核表達體系,表達產物經快速蛋白質液相色譜系統(tǒng)(FPLC)純化后,逆向蒸發(fā)法制備重組蛋白的脂質體疫苗,并在BALB/c小鼠模型中評價其對Hp感染的免疫保護作用,并對其免疫保護機制進行探討.方法:1.運用PCR技術從Hp總DNA中擴增出UreB結構基因,裝入pT(pGEM-T-easy

2、 vector)載體進行序列分析,將UreB基因亞克隆入表達載體pET-22b(+)并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達,采用FPLC系統(tǒng)經Sephacyl S-200凝膠過濾和Sepharose Fast Flow陰離交換兩步層析獲得純化rUreB,免疫印跡法檢測抗原性.2.運用PCR技術從Hp總DNA中擴增出Kat結構基因,裝入pET-22b(+)載體進行序列分析,并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達,貝爾斯-西策爾斯(Beers

3、& Sizers)法測定重組過氧化氫酶活性,表達Kat包涵體經分離、洗滌、溶解、復性,采用FPLC系統(tǒng)經Sepharose Fast Flow陰離了交換、Octyl-Sepharose-4FF疏水層析、Sephacyl S-200凝膠過濾層析獲得純化的rKat.3.用逆向蒸發(fā)法制備以卵磷脂和膽固醇為膜組分包裹的重組蛋白和有/無免疫佐劑的口服疫苗,并用透射電鏡測定其粒徑.結論:1.應用基因重組技術構建分別pET-22b(+)/UreB和p

4、ET-22b(+)/Kat重組質粒,并在大腸桿菌中表達,表達產物經快速蛋白質液相色譜系統(tǒng)(FPLC)純化后,獲得了純化的重組蛋白,為Hp疫苗的研制提供了物質基礎;2.首次用逆向蒸發(fā)法制備以卵磷脂和膽固醇為膜組分包裹的重組蛋白口服疫苗,并在BALB/c小鼠Hp感染模型中證實了脂質體能代替霍亂毒素的黏膜免疫佐劑作用;3.動物實驗證明Hp疫苗能降低Hp在小鼠胃內的定植密度,同時能減輕胃黏膜炎癥反應程度,雙價疫苗較單價疫苗免疫保護作用更強;4.