幽門螺桿菌多亞單位疫苗的篩選及免疫保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)感染是慢性胃炎、消化性潰瘍以及胃癌、胃粘膜組織淋巴瘤(MALT)等疾病的重要致病因素，世界衛(wèi)生組織已將其列為一類致癌因子。目前，H.pylori疫苗已由傳統(tǒng)的全菌滅活疫苗發(fā)展到以基因工程亞單位疫苗、減毒活菌載體疫苗、核酸疫苗為代表的新型疫苗。其中，基因工程亞單位疫苗具有組分清楚、安全性好、技術(shù)成熟、便于產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)，成為H.pylori疫苗研究的重點(diǎn)。然而，單一抗原組分

2、疫苗難以產(chǎn)生全面、有效的免疫保護(hù)，而多抗原組分疫苗可以激發(fā)機(jī)體更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，將會(huì)是更完美的疫苗形式。因此，H.pylori疫苗發(fā)展方向?qū)⑹且远鄟唵挝粸橹鞯穆?lián)合疫苗設(shè)計(jì)。 亞單位疫苗的設(shè)計(jì)需要相應(yīng)佐劑輔佐來(lái)增強(qiáng)免疫效果。經(jīng)典的鋁佐劑是第一個(gè)批準(zhǔn)用于人用疫苗的佐劑，在安全性和增強(qiáng)疫苗免疫原性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。H.pylori感染的最初部位是胃粘膜，據(jù)此研究H.pylori粘膜疫苗以激發(fā)機(jī)體有效的局部粘膜免疫和系統(tǒng)免疫成為H.pyl

3、ori疫苗研究的一個(gè)重要方向。大腸桿菌不耐熱腸毒素(Heat-labileenterotoxin，LT)及其突變體是一種常用的粘膜佐劑，可有效啟動(dòng)機(jī)體局部和系統(tǒng)的體液免疫和細(xì)胞免疫，成為粘膜疫苗研究的主要佐劑。 H.pylori感染的免疫保護(hù)機(jī)制較為復(fù)雜，而針對(duì)H.pylori自然感染后免疫應(yīng)答特點(diǎn)設(shè)計(jì)出的不同類型H.pylori疫苗的免疫應(yīng)答機(jī)制也存在差異。在體液免疫方面，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為粘膜局部sIgA的產(chǎn)生可發(fā)揮免疫保護(hù)作用，

4、但仍有少數(shù)研究得出不同結(jié)論：可能是IgG而非IgA產(chǎn)生的保護(hù)作用。在細(xì)胞免疫方面，已有很好的證據(jù)證實(shí)：CD4+T細(xì)胞是必需的。但對(duì)于輔助性T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答類型(Th1和Th2)與保護(hù)性免疫應(yīng)答的關(guān)系，卻出現(xiàn)了多種觀點(diǎn)：針對(duì)H.pylori感染的保護(hù)性免疫主要來(lái)自Th1型或Th2型，還是Th1/Th2混合型應(yīng)答，尚未定論?？傊?，疫苗接種后的免疫保護(hù)機(jī)制仍然不十分清楚，還有待進(jìn)一步細(xì)致研究。 本課題以H.pyloriUreB、H

5、spA和HpaA三種重組蛋白為侯選保護(hù)性抗原，分別輔以粘膜佐劑LT突變體(LTR72DITH)和氫氧化鋁(Al(OH)3)佐劑設(shè)計(jì)H.pylori多亞單位疫苗，口服或注射免疫蒙古沙鼠并以H.pylori動(dòng)物適應(yīng)菌株感染攻擊，進(jìn)行多亞單位疫苗組合的篩選比較，評(píng)價(jià)其保護(hù)效果以獲得最佳疫苗形式。在此基礎(chǔ)上，對(duì)所篩選獲得的H.pylori多亞單位疫苗進(jìn)行體外細(xì)胞免疫試驗(yàn)和體內(nèi)免疫應(yīng)答分析，以探討該疫苗的保護(hù)性免疫應(yīng)答機(jī)制，為H.pylori疫苗

6、的進(jìn)一步設(shè)計(jì)與完善奠定基礎(chǔ)。本課題的主要研究方法、結(jié)果與結(jié)論如下： 1.分別采用不同的純化方案對(duì)H.pylori重組保護(hù)性抗原UreB、HspA、HpaA以及重組LT突變體進(jìn)行純化與檢定。純化后rUreB、rHspA、rHpaA的蛋白純度分別約為95.7％、98.2％和98.3％，且均保持良好的免疫反應(yīng)性。粘膜佐劑重組LT突變體(LTR72DITH)經(jīng)親和層析后，其純度約為99％，以六聚體形式存在，保持了良好的結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂GM

7、1的能力。以H.pylori三種保護(hù)性抗原分別輔以粘膜佐劑和鋁佐劑制備出不同組合的亞單位疫苗，為下一步的疫苗動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究奠定良好基礎(chǔ)。 2.采用H.pylori動(dòng)物適應(yīng)菌株M13感染蒙古沙鼠，成功建立動(dòng)物模型為疫苗免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，根據(jù)H.pylori16SrRNA編碼基因設(shè)計(jì)引物建立H.pylori感染的PCR檢測(cè)方法，適用于胃組織和糞便標(biāo)本中少量H.pylori的檢出，有利于活體動(dòng)物的H.pylori感染動(dòng)態(tài)監(jiān)

8、測(cè)。 3.以rUreB、rHpaA、rHspA為保護(hù)性抗原，輔以粘膜佐劑LTR72DITH設(shè)計(jì)出多種亞單位疫苗組合，經(jīng)口服免疫后進(jìn)行免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)。不同組合疫苗的保護(hù)率排序?yàn)椋喝齺唵挝灰呙?89.4％)＞雙亞單位疫苗(52.5％、55.5％)＞單亞單位疫苗(41.9％)，其中，三亞單位疫苗組的免疫保護(hù)率與其他亞單位疫苗組相比存在顯著差異(P＜0.05)。由此可見(jiàn)：H.pylori三亞單位粘膜佐劑疫苗經(jīng)口服免疫獲得的保護(hù)效果最好

9、。 4.以rUreB、rHpaA、rHspA為保護(hù)性抗原，輔以Al(OH)3佐劑設(shè)計(jì)出多種亞單位疫苗組合，經(jīng)注射免疫后進(jìn)行免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)。不同組合疫苗的保護(hù)率排序?yàn)椋喝齺唵挝灰呙?57.9％)＞雙亞單位疫苗(47.4％、44.6％)＞單亞單位疫苗(36.8％)，但各亞單位疫苗組間的免疫保護(hù)率相差不顯著(P＞0.05)，其中三亞單位鋁佐劑疫苗的免疫保護(hù)效果略好。 5.對(duì)LTR72DITH佐劑三亞單位疫苗和Al(OH)3佐

10、劑三亞單位疫苗進(jìn)行進(jìn)一步免疫保護(hù)效果比較，LTR72DITH佐劑三亞單位疫苗的免疫保護(hù)率(約86.3％)高于Al(OH)3佐劑三亞單位疫苗(約53.4％)，兩者存在顯著差異(P＜0.05)。同時(shí)，兩種疫苗均在四次免疫后血清特異性IgG抗體水平達(dá)到最高，其中Al(OH)3佐劑疫苗的IgG水平高于LTR72DITH佐劑疫苗。結(jié)論：H.pylori三亞單位粘膜佐劑疫苗的免疫保護(hù)效果顯著好于三亞單位鋁佐劑疫苗。 6.采用細(xì)胞因子(GM-

11、CSF)誘導(dǎo)法從小鼠骨髓細(xì)胞中體外培養(yǎng)出樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)，光鏡和掃描電鏡下細(xì)胞形態(tài)典型，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示：其高表達(dá)CD11c(72.89％Gated)，低表達(dá)MHCⅡ(31.11％Gated)和CD86(37.11％Gated)，為未成熟DC表型；而經(jīng)LPS刺激后細(xì)胞高表達(dá)CD11c(75.89％Gated)、MHCⅡ(61.11％Gated)和CD86(57.33％Gated)，為成熟DC表型。未成熟DC具有極強(qiáng)的抗原吞噬能力，且

12、能刺激同種異體混合淋巴細(xì)胞發(fā)生明顯增殖。 7.將H.pylori三亞單位粘膜佐劑疫苗與未成熟DC共培養(yǎng)后，未成熟DC可有效攝取H.pylori疫苗抗原，并成熟化，其表型特征為CD11c(74.50％)、MHCⅡ(66.85％)、CD86(62.99％)，分泌多種細(xì)胞因子，其中IL-10和IL-4水平較抗原組和佐劑組顯著升高(P＜0.01)。同時(shí)，H.pylori疫苗作用的BMDC可顯著刺激混合淋巴細(xì)胞增殖，尤其是CD4+T淋巴細(xì)

13、胞增殖明顯。流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+T淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-4和IFN-γ，結(jié)果顯示：疫苗作用DC可明顯刺激CD4+T淋巴細(xì)胞的IL-4和IFN-γ表達(dá)水平增高，且前者顯著高于后者。上述體外試驗(yàn)結(jié)果表明：H.pylori亞單位疫苗在被DC攝取后可促使DC成熟化，產(chǎn)生高水平IL-10和IL-4，顯著刺激CD4+T淋巴細(xì)胞增殖分化，分泌IL-4和IFN-γ，誘導(dǎo)以Th2型應(yīng)答為主的Th1/Th2混合應(yīng)答。 8.H.pylori三亞單位粘膜佐

14、劑疫苗口服免疫BALB/c小鼠后，腸粘膜DC攝取抗原并向粘膜下淋巴組織遷移，抗原示蹤試驗(yàn)顯示疫苗抗原可在腸粘膜下淋巴組織(PP結(jié))及脾富集。H.pylori疫苗可刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的血清特異性IgG抗體，促使腸液、唾液及糞便中抗原特異sIgA水平顯著升高，有效激發(fā)粘膜免疫應(yīng)答。同時(shí)，誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞IL-4和IFN-γmRNA表達(dá)水平增高，且前者顯著高于后者。因此，H.pylori三亞單位粘膜佐劑疫苗口服免疫后可誘導(dǎo)產(chǎn)生粘膜局部和全身性體液