重組表達幽門螺桿菌致病島CagL蛋白及其抗體阻斷粘附試驗.pdf

1、幽門螺桿菌(H.pylori.Hp)在全球的感染率超過50％，它是慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因子，還與腸型胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。H.pylori侵入機體后能夠產(chǎn)生損傷胃粘膜的毒素，并誘發(fā)機體一系列炎癥、免疫反應(yīng)，這與其在胃粘膜定植生存有關(guān)。致病的H.pylori菌株含有一個約40kb的特殊基因片段，即cag致病島(cytotoxin associated gene pathogenicity isla

2、nd，cag PAI)，該基因序列呈高密度分布并編碼一個分泌轉(zhuǎn)運系統(tǒng)稱為Ⅳ型分泌系統(tǒng)(type IV secretion system，TFSS)。在H.pylori粘附定植的過程中，H.pylori致病因子是通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運進入宿主細胞的，在轉(zhuǎn)運過程中CagL蛋白的參與非常重要。它通過H.pylori菌毛與宿主接觸，導(dǎo)致黏著斑激酶(FAK)和Src家族激酶(Src farrulykinases，SFKs)的活化及酪氨酸磷酸化，誘導(dǎo)

3、肌動蛋白細胞骨架重新排列，細胞漿膜的動態(tài)變化，整合素的聚集及其它受體的活化；同時活化的Src刺激下游信號系統(tǒng)，導(dǎo)致宿主細胞誘導(dǎo)促炎癥反應(yīng)細胞因子如IL-8的合成和分泌。CagL的這些生物學(xué)行為對H.pylori致病因子進入宿主的細胞和引發(fā)宿主細胞病理改變極為重要。因此，本研究擬對CagL基因進行克隆表達，制備多克隆抗體進行阻斷粘附試驗，這將有助于進一步明確CagL在H.pylori致病性及定植機制中的作用，并為研制H.pylori疫苗奠

4、定基礎(chǔ)。 方法和結(jié)果： 1.重組幽門螺桿菌CagL蛋白的表達、純化 采用PCR方法以H.pylori(NCTC11639株)基因組DNA為模板，擴增cagL基因片段并構(gòu)建在原核表達載體PET-22b(+)中，通過酶切、測序鑒定陽性重組子。將含目的基因片段的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中，酶切鑒定和基因測序結(jié)果顯示，幽門螺桿菌cagL基因被J下確克隆到PET-22b(+)中。 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件D

5、NAssist和GenBank數(shù)據(jù)庫對已公布的H.pylori基因序列進行相似性分析?？寺agL基因的核苷酸序列長度為714bp，與GenBank中(11639)序列比較，基因相似性為IOO％。 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE分析，目的蛋白表達率約為40％，超聲破菌后電泳鑒定目的蛋白以包涵體形式表達。用AKTA-explore純化系統(tǒng)純化出CagL。用SDS-PAGE對純化產(chǎn)物分析表明CagL的純度>90％。Western

6、 blot結(jié)果顯示重組幽門螺桿菌CagL蛋白具有與抗H.pylori多克隆抗體血清的免疫反應(yīng)性； 2.制備兔抗CagL多克隆抗體血清及其鑒定 以純化蛋白為抗原加弗氏佐劑免疫家兔，制備兔抗CagL多克隆抗體血清，雙擴試驗和ELISA試驗鑒定其免疫性。ELISA檢測出多克隆血清的效價為1：16，000。經(jīng)雙向免疫擴散檢測，多克隆血清效價為1:16。 3.兔抗CagL多克隆抗體血清對幽門螺桿菌粘附阻斷實驗： 3

7、.1 CagL多克隆抗體血清對幽門螺桿菌粘附阻斷實驗 將幽門螺桿菌接種于H.pylori選擇培養(yǎng)基中，在5％O2，85％ N2，10％ CO2，37℃條件下培養(yǎng)，24h后挑菌進行形態(tài)及生化鑒定。將H.pylori培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600nm=0.6)。再將H.pylori和CagL多克隆抗體中和后加入貼壁生長在蓋玻片上的Hela細胞中，37℃、5％CO2共同孵育4h，分別加入H.pylori和DH5α菌作為陽性對照及陰性對照

8、。姬姆薩染色結(jié)果顯示CagL多克隆抗體有阻斷幽門螺桿菌粘附定植Hela細胞能力。 3.2 酶聯(lián)免疫吸附測定分析IL-8濃度 用3.1的操作方法，取細胞上清液，用酶聯(lián)免疫吸附測定分析IL-8濃度。 結(jié)果顯示：CagL多克隆抗體血清預(yù)先中和的H.pylori和未中和的H.pylori對照間有顯著性差異(p<0.05)，前者IL-8水平顯著低于后者。表明CagL多克隆抗體血清與H.pylori抗原充分結(jié)合后，可以減少H

9、.pylori促進細胞分泌IL-8的能力。 結(jié)論： 本研究成功構(gòu)建、表達、純化出的重組幽門螺桿菌CagL蛋白，具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。阻斷粘附實驗說明制備的CagL多克隆抗體血清對阻斷H.pylori的粘附能力發(fā)揮了重要的作用。細胞因子IL-8的檢測表明CagL多克隆抗體血清可以減少H.pylori促進細胞分泌IL-8的能力。以上實驗說明CagL蛋白在H.pylori定植并轉(zhuǎn)化CagA進入細胞和誘導(dǎo)細胞表達IL-