原核表達幽門螺桿菌中性粒細胞激活蛋白及其對小鼠哮喘的預防研究.pdf

1、目的：本研究旨在構(gòu)建中性粒細胞激活蛋白原核表達質(zhì)粒，通過原核表達獲得純化重組幽門螺桿菌中性粒細胞激活蛋白；以卵清蛋白（OVA）誘導小鼠建立哮喘動物模型；并使用重組HP-NAP(rNAP)對模型小鼠進行干預，探索重組HP-NAP在哮喘防治方面的作用及機制。
　　方法：目的基因的擴增、克隆及序列分析——取幽門螺桿菌臨床兒童分離株GZCH1全基因組DNA為模板，用根據(jù)GenBankHPSS1NAP（AF227072）序列設(shè)計的特異性引物

2、NAP/P1、P2，通過PCR技術(shù)擴增NAP基因，PCR產(chǎn)物純化后將其克隆入原核表達載體pET-28a(+)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5a，挑取經(jīng)卡那霉素篩選的陽性菌落提取質(zhì)粒，進行雙酶切、PCR鑒定及測序分析。
　　目的蛋白的表達、純化及抗原性分析——將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21，以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導重組菌表達，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）及免疫印跡

3、法（WesternBlot，WB）分析表達結(jié)果。使用Ni2+-NTA親和層析柱純化目的蛋白。SDS-PAGE確定純化蛋白中無雜帶后使用BCA法測定蛋白濃度。使用純化蛋白免疫大鼠，得到抗血清，測定抗血清滴度并進行WB分析蛋白抗原性。并使用純化的重組NAP包被ELISA板，對HP感染病人血清進行NAP特異性IgM檢測。
　　動物造模與rNAP干預處理——于第1、7天給6周BALB/c小鼠注射/吸入rNAP，第14天開始按動物造模手冊中

4、的標準方法進行小鼠哮喘造模，至第46天造模完畢，24-48小時內(nèi)完成采血、收集肺泡灌洗液及肺組織等標本收集。隨后完成血清IgE水平、肺泡灌洗液中細胞炎癥因子水平的測定及觀察肺組織切片中的組織病變情況。
　　結(jié)果：PCR擴增出大小約430bp左右的片段并將其成功克隆入pET-28a(+)載體。序列比對分析顯示NAP開放閱讀框長435bp，預測編碼144個氨基酸，分子量為16904.92，等電點為5.69。經(jīng)NCBIBLAST比對與幽

5、門螺桿菌J99株和51株比對相符度均達99％。本實驗成功構(gòu)建高效表達載體pET-28a(+)-NAP，并獲得分子量約17kDa的可溶性融合表達蛋白。用該蛋白免疫大鼠獲得多克隆抗血清效價高達1：51200，蛋白印跡陽性證明其免疫原性及免疫反應(yīng)性均很強。純化的rNAP包被ELISA板，對HP感染病人血清進行NAP特異性IgM檢測，敏感度與特異度分別為91.89％和85％。
　　將經(jīng)純化的rNAP分別通過腹腔注射/霧化吸入方式作用于小鼠

6、哮喘模型，結(jié)果表明與模型相比，兩種途徑給藥均可上調(diào)促Th1反應(yīng)的IFN-γ在肺組織細胞中的分泌，與模型組間差異具有統(tǒng)計學差異；并減緩小鼠的哮喘相關(guān)指征，明顯降低肺組織的嗜酸性粒細胞積累、炎癥細胞浸潤程度及粘膜增厚等典型過敏性炎癥，抑制血清中總IgE水平（P<0.01），差異具有統(tǒng)計學意義；過敏相關(guān)的Th2炎癥因子IL-4、IL-13水平顯著低于模型組水平（P<0.01），差異具統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：成功克隆、表達了HP-NAP基