cagA和cagL對幽門螺桿菌侵襲細胞功能的影響.pdf

1、目的：
　　幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）可以侵入胃黏膜上皮細胞并在胃上皮細胞內(nèi)繁殖進而參與致病作用。但幽門螺桿菌侵襲胃黏膜上皮細胞的機制尚不明確。研究已證實細胞的β1整合素可介導Hp侵入細胞，但尚不清楚細菌與侵襲相關的毒力因子。鑒于此，本研究將從已知幽門螺桿菌的CagA和CagL能與β1整合素結(jié)合為切入點，探究cagA和cagL兩基因?qū)p侵襲細胞功能的影響，旨在揭示與Hp侵襲細胞功能相關的毒力因子。

2、
　　方法：
　　1、幽門螺桿菌NCTC11637cagL缺失株的構(gòu)建
　　參考NCBI HpJ99全基因組序列，設計NCTC11637cagL同源臂，將卡那霉素抗性基因(kanaR)連接到PCR擴增cagL基因兩端區(qū)域產(chǎn)生的兩個同源臂之間，而后插入pBluescript SKⅡ（-）載體中，構(gòu)建出帶卡那霉素抗性標志的重組質(zhì)粒。運用基因同源重組方法，將此重組質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化到NCTC11637中，以卡那霉素抗性基因替換

3、cagL基因，通過卡那霉素羊血平板篩選出NCTC11637cagL缺失株，命名為NCTC11637ΔcagL，傳25代，經(jīng)尿素酶和PCR鑒定，以證實遺傳穩(wěn)定性。
　　2、AGS細胞與SGC7901細胞β1整合素表達驗證
　　采用Trizol法提取兩株細胞的總RNA，通過RT-PCR獲得cDNA，以此為模板PCR，對β1整合素進行mRNA水平表達驗證；利用膜蛋白提取試劑盒提取兩株細胞總膜蛋白，用抗β1整合素抗體進行wester

4、n blot對β1整合素進行蛋白水平表達驗證。
　　3、cagA和cagL對幽門螺桿菌侵襲AGS細胞與SGC7901細胞功能的影響
　　以NCTC11637、NCTC11637ΔcagL和NCTC11637ΔcagA（由本實驗室構(gòu)建并保存）感染AGS細胞與SGC7901細胞（MOI=50，MOI為細菌數(shù)和細胞數(shù)的比值），一部分細胞于感染2h后洗滌裂解，裂解物涂布細菌培養(yǎng)板，培養(yǎng)后進行菌落計數(shù)，此為粘附細胞細菌數(shù)；另一部分細胞

5、感染2h后，利用慶大霉素保護性侵襲實驗，2h后，裂解細胞，裂解物涂布細菌培養(yǎng)板，培養(yǎng)后進行菌落計數(shù)，此為侵入細胞菌數(shù)。通過計算侵襲粘附比反映cagA和cagL對幽門螺桿菌侵襲能力的影響，侵襲粘附比=（侵入細胞菌數(shù)/粘附細胞菌數(shù)）×100％。
　　4、cagA和cagL對幽門螺桿菌在細胞內(nèi)存活時間的影響
　　以 NCTC11637、NCTC11637ΔcagL和NCTC11637ΔcagA感染 AGS細胞（MOI=50），利用

6、慶大霉素保護性侵襲實驗，以含慶大霉素25μg/ml的細胞培養(yǎng)液持續(xù)培養(yǎng)，分別在24h，36h，48h，72h，96h終止實驗，進行細菌培養(yǎng)和菌落計數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1、利用同源重組基因敲除技術(shù)成功構(gòu)建了幽門螺桿菌 NCTC11637 cagL缺失株NCTC11637ΔcagL；經(jīng)傳25代，尿素酶和PCR鑒定，證明缺失突變株穩(wěn)定；
　　2、AGS細胞和SGC7901細胞均可以表達β1整合素，相對灰度值結(jié)果表明，AGS

7、細胞β1整合素表達（6.387±2.957）高于SGC7901細胞（4.442±2.382）；
　　3、cagA和cagL對幽門螺桿菌侵襲AGS細胞與SGC7901細胞功能的影響
　?。?）NCTC11637對AGS細胞的侵襲作用（28.285±4.646%）強于SGC7901細胞（0.194±0.038%）；
　　（2）AGS細胞中，NCTC11637、NCTC11637ΔcagA和NCTC11637ΔcagL的侵襲

8、粘附比分別為28.285±4.646%、9.055±3.104%和9.225±0.417%，NCTC11637ΔcagA和NCTC11637ΔcagL的侵襲粘附比均顯著低于 NCTC11637（P<0.05），NCTC11637ΔcagA和NCTC11637ΔcagL侵襲粘附比差異無顯著性；
　?。?）SGC7901細胞中，NCTC11637、NCTC11637ΔcagA和NCTC11637ΔcagL的侵襲粘附比分別為0.194±

9、0.038%、0.029±0.007%和0.061±0.009%，NCTC11637ΔcagA的侵襲粘附比顯著低于 NCTC11637（P<0.01），NCTC11637ΔcagL的侵襲粘附比顯著低于NCTC11637（P<0.05）。
　　4、NCTC11637、NCTC11637ΔcagA和NCTC11637ΔcagL感染 AGS細胞后，隨著培養(yǎng)時間延長，胞內(nèi)細菌數(shù)逐漸減少，NCTC11637ΔcagL在胞內(nèi)可存活72h，NC