幽門螺桿菌CagA與YWHAE相互作用對細胞遷移的影響.pdf

1、目的：
　　細胞毒素相關蛋白A(CagA)是幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）的重要毒力因子，與胃腺癌的發(fā)生密切相關。本研究在已證實CagA與胃黏膜上皮細胞YWHAE蛋白具有相互作用的前提下，應用cagA野生株與缺失突變株的對比實驗，驗證CagA對細胞功能的影響，進而在此基礎上探討CagA與YWHAE相互作用對胃黏膜上皮細胞遷移的影響，旨在進一步闡明Hp CagA的致病機制。
　　方法：
　　1

2、.CagA及YWHAE在細胞定位上的驗證：通過Hp NCTC11637標準株感染AGS細胞和SGC7901細胞后，分別采用CagA及YWHAE的特異性抗體處理細胞，用激光共聚焦顯微鏡觀察CagA和YWHAE在細胞中的定位。
　　2.構建NCTC11637 cagA基因缺失株NCTC11637ΔcagA：采用基因敲除同源重組原理，構建帶卡那霉素抗性標志的cagA缺失突變質粒，電擊轉化到NCTC11637標準株中，用卡那霉素篩選出NC

3、TC11637ΔcagA，用PCR和Western blot技術鑒定cagA基因的缺失及CagA蛋白的表達情況，將NCTC11637△cagA連續(xù)傳25代進行cagA基因缺失遺傳穩(wěn)定性的鑒定。
　　3.NCTC11637 CagA對SGC7901細胞生物學功能的影響：將NCTC11637和NCTC11637ΔcagA以MOI(Bacterium/Cell)=100分別感染SGC7901細胞，進行以下實驗：Hp感染細胞5天，每天用M

4、TS法檢測細胞的增殖，細胞增殖率=OD2-5d/OD1d； Hp感染細胞48h，用流式細胞儀分別檢測細胞凋亡及細胞周期；劃痕劃線法檢測細胞遷移情況：Hp感染細胞6h后，對細胞進行劃痕劃線處理，用Carl Zeiss License Activation Tool對細胞進行拍照測量劃痕寬距，48h后觀察細胞遷移情況，細胞遷移距離=6h劃痕寬距-48h劃痕寬距。
　　4.構建YWHAE過表達及沉默的AGS細胞及SGC7901細胞：將本

5、實驗室已構建好的YWHAE真核表達質粒pCMVTNT-YWHAE及YWHAE siRNA分別通過轉染試劑Lipofectamine2000及X-tremeGENE siRNA transfection reagent轉染AGS及SGC7901細胞，48h后分別進行Western blot驗證YWHAE蛋白的表達情況及YWHAE siRNA的干擾效果。
　　5.CagA和YWHAE的相互作用對細胞遷移功能的影響：將本實驗室已構建好的

6、CagA真核表達質粒pCMVTNT-cagA，通過轉染試劑Lipofectamine2000轉染AGS及SGC7901細胞，48h后進行Western blot的驗證；用不同濃度的pCMVTNT-cagA及pCMVTNT-YWHAE分別轉染AGS及SGC7901細胞，采用劃痕劃線法檢測細胞的遷移情況；選擇適當濃度的pCMVTNT-cagA及 pCMVTNT-YWHAE（或YWHAEsiRNA）共轉染AGS和SGC7901細胞，同法檢測細

7、胞遷移情況。
　　6.統(tǒng)計學分析：采用SPSS20.0進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、析因設計方差分析進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。
　　結果：
　　1.通過細胞免疫熒光共定位，可以在AGS細胞及SGC7901細胞的胞漿中觀察到CagA與YWHAE同時存在，表明了CagA與YWHAE能共定位于AGS細胞及SGC7901細胞漿中。
　　2.經(jīng)PCR、Western blot鑒定成功構建了NCTC11637 cagA基因缺失株，

8、并經(jīng)連續(xù)傳25代，證明獲得了可穩(wěn)定遺傳的NCTC11637ΔcagA。
　　3. NCTC11637 CagA對細胞生物學功能影響的驗證
　?。?）細胞增殖方面：細胞培養(yǎng)至第3-5天，NCTC11637組細胞增殖速率大于NCTC11637ΔcagA組，經(jīng)統(tǒng)計學分析，第3天及第5天有顯著性差異（P<0.05）；
　　（2）細胞凋亡方面：細胞凋亡率NCTC11637組（1.82％）較NCTC11637ΔcagA組（2.55

9、%）低（P<0.01）；
　　（3）細胞周期方面：NCTC11637組 G1期、S期、G2期細胞百分數(shù)分別為60.77%、25.4%、13.04%，NCTC11637ΔcagA組G1期、S期、G2期細胞百分數(shù)分別為56.78%、28.27%、13.95%，經(jīng)統(tǒng)計學分析，兩組間在各期內比較有顯著性差異（P<0.05）；
　?。?）細胞遷移方面：NCTC11637組細胞遷移距離（147.39μm）較NCTC11637ΔcagA組

10、細胞遷移距離（81.65μm）大（P<0.05）。
　　4.構建YWHAE過表達及沉默的AGS及SGC7901細胞
　　通過Western bolt驗證，AGS及 SGC790細胞中YWHAE蛋白的表達量：pCMVTNT-YWHAE組高于陰性對照pCMV-TNT組，YWHAE siRNA組低于陰性對照無關siRNA組（NC組）。
　　5.CagA與YWHAE的相互作用對細胞遷移的影響
　?。?）通過Western

11、 bolt驗證，在AGS及SGC790細胞中CagA蛋白的表達量：pCMVTNT-cagA組高于陰性對照pCMV-TNT組。
　?。?）在AGS及SGC7901細胞中均可觀察到：
　　a.隨著pCMVTNT-cagA濃度的增高，細胞遷移距離逐漸增加；而隨著pCMVTNT-YWHAE濃度的增高，細胞遷移距離逐漸減少；
　　b.共轉pCMVTNT-cagA、pCMVTNT-YWHAE后：細胞遷移距離CMV-YWAHE

12、VTNT　　c.共轉pCMVTNT-cagA、YWHAE siRNA后：細胞遷移距離CMV-YWAHE+NC　　結論：
　　1.空間定位證明CagA和YWHAE可在細胞內相互作用。
　　2.N