幽門螺旋桿菌毒力蛋白CagA對B淋巴細(xì)胞IgAl分泌和低糖基化的影響.pdf

1、目的:IgA腎病是全世界范圍內(nèi)一種常見的原發(fā)性腎小球疾病，在我國已成為導(dǎo)致慢性腎功能衰竭最主要的腎小球疾病，大約25％～50％的患者在疾病診斷后25年內(nèi)發(fā)展到終末期腎衰竭(ESRD);幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)在中國乃至整個亞太地區(qū)人群中具有高感染率，目前已有研究提示Hp感染可能與IgA腎病發(fā)病有關(guān)，但缺乏相關(guān)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，具體致病機(jī)制也不明。本實(shí)驗(yàn)通過檢測Hp的毒力蛋白——細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白(CagA)

2、對人B細(xì)胞分泌的IgA1以及糖基化影響，初步研究Hp與IgA的相關(guān)性，并通過檢測C1GALT1及Cosmc基因的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討HP參與IgA腎病發(fā)生的分子機(jī)制，其研究結(jié)果可為明確Hp與IgA腎病發(fā)生的相關(guān)性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為治療伴有Hp感染的IgA腎病提供新的思路。
　　方法:以培養(yǎng)的人B淋巴細(xì)胞系DAKIKI細(xì)胞為研究對象，在劑量依賴實(shí)驗(yàn)（給予不同濃度的CagA蛋白刺激，培養(yǎng)48 h）和時間依賴實(shí)驗(yàn)（以1.6μg/ml的C

3、agA刺激培養(yǎng)24h、48h、72h）中，采用細(xì)胞計數(shù)法和CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測培養(yǎng)上清中IgA1濃度，HAA凝集素結(jié)合試驗(yàn)法檢測低糖基化程度，并在最適刺激濃度和作用時間條件下，運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR和Western blot法分別檢測細(xì)胞內(nèi)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶C1GALT1和伴侶蛋白Cosmc在基因與蛋白水平的表達(dá)變化，探討CagA引起人B淋巴細(xì)胞分泌的IgA1異常糖基化的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:

4、劑量依賴試驗(yàn)中，細(xì)胞計數(shù)與CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，一定濃度范圍的CagA可促進(jìn)B細(xì)胞增殖，而較高濃度的CagA（3.2μg/ml）表現(xiàn)為明顯的抑制作用，ELISA結(jié)果顯示，不同濃度的CagA均可促進(jìn)B細(xì)胞分泌IgA1，其中以1.6μg/ml的CagA效果最為顯著，HAA凝集素結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果顯示，1.6μg/ml和3.2μg/ml的CagA蛋白可明顯增加IgA1分子的低糖基化水平;時間依賴試驗(yàn)中，在不同的時間點(diǎn)，1.6μg/ml

5、的CagA蛋白刺激組與對應(yīng)的對照組相比，均出現(xiàn)IgA1分泌和低糖基化程度的增加，并呈明顯的時間依賴性;綜合以上結(jié)果，最終確定以1.6μg/mlCagA作用48h進(jìn)行后續(xù)機(jī)制探討:實(shí)時熒光定量RT-PCR與Western blot研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，CagA組與LPS組（12.5μg/ml）的C1GALT1和Cosmc的表達(dá)在基因和蛋白水平均出現(xiàn)明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:CagA可促進(jìn)B細(xì)胞增殖，引起IgA1