抗原特異性的分子基礎(chǔ)

1、第二章 抗原特異性的分子基礎(chǔ),一、抗原的概念二、抗原的分類三、抗原決定簇四、抗原結(jié)構(gòu)的免疫化學(xué),ICA-WYS,,,,,,,,ICA-WYS,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2008,"for his discovery of human papilloma（乳頭瘤） viruses causing cervical cancer&quo

2、t;,1/2 of the prizeGERMANY,ICA-WYS,,,,"for their discovery of human immunodeficiency virus",1/4 of the prize FRANCE,ICA-WYS,,,什么是抗原（ antigen,Ag ） ？ 抗原如何分類？,ICA-WYS,,,,問題,一、抗原的概念,抗原（antigen,Ag）概念是一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)

3、產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答 ，并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)免疫應(yīng)答 (immune response) 免疫細(xì)胞對(duì)抗原分子的識(shí)別、活化、分化和效應(yīng)過程,ICA-WYS,,,,ICA-WYS,免疫原性（immunogenicity，抗原性）指抗原能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，即產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力 反應(yīng)原性 (immunoreactivity，免疫反應(yīng)性）指抗原與相應(yīng)免疫效應(yīng)物質(zhì)（抗體和致敏淋巴細(xì)胞）在體內(nèi)

4、或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的特性,ICA-WYS,,,,ICA-WYS,10,,免疫系統(tǒng),抗原,,,抗體或致敏淋巴細(xì)胞,,,,體內(nèi)外特異性結(jié)合（免疫反應(yīng)性）,,免疫原性,,ICA-WYS,,既有免疫原性又有免疫反應(yīng)性的抗原稱為免疫原 （immunogen）,ICA-WYS,6,,,ICA-WYS,30,二 、抗原的分類,完全抗原 (complete antigen) 具有免疫原性和反應(yīng)原性的抗原 半抗原 (hapten) 有反應(yīng)原性

5、，無免疫原性,ICA-WYS,,,ICA-WYS,30,半抗原(Hapten),具有免疫反應(yīng)性 , 沒有免疫原性的小分子物質(zhì),,小分子,,免疫應(yīng)答 （immune response）,,,+,,載體 carrier,,,,,,,,,,,,,,半抗原+載體=完全抗原,載體(carrier)：賦予半抗原免疫原性的大分子物質(zhì),,,什么是抗原的特異性 ？ 決定抗原特異性的物質(zhì)基礎(chǔ) ？,ICA-WYS,,,,問題,抗原的特異性（antigen

6、specificity),指抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答并與免疫應(yīng)答產(chǎn)物發(fā)生專一結(jié)合的特性,,,決定抗原特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)？,ICA-WYS,,,決定抗原特異性的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)抗原表位(epitope)亦稱為抗原決定簇（antigenic determinant, AD),ICA-WYS,,,三、抗原決定簇（表位）,抗原分子表面上一小部分具有化學(xué)活性的區(qū)域注意：抗原決定簇, 而非 整個(gè)抗原決定抗原的 特異性,ICA-

7、WYS,,,意義 AD是被免疫細(xì)胞識(shí)別的靶結(jié)構(gòu)，是免疫反應(yīng)具有特異性的物質(zhì)基礎(chǔ) AD大小、數(shù)目、性質(zhì)、構(gòu)型和構(gòu)象決定著抗原的特異性,ICA-WYS,,,43,ICA-WYS,抗原決定簇分子大小 受抗體抗原結(jié)合部位大小限制1個(gè)蛋白質(zhì)或多肽分子的AD含5~7個(gè)氨基酸殘基1個(gè)多糖AD含5~7個(gè)葡萄糖殘基,ICA-WYS,,,(一) 抗原決定簇對(duì)抗原特異性的影響,ICA-WYS,抗原決定簇位點(diǎn)分布抗原決定簇的位點(diǎn)分布對(duì)抗原特異性具

8、有決定性意義,ICA-WYS,,,ICA-WYS,Sela等用多聚-DL-Ala和聚-L-Lys合成的多肽研究,圖2-3 3種合成的叉鏈多聚氨基酸,ICA-WYS,,,AD外露分子表面,AD處于分子內(nèi)側(cè),殘基側(cè)鏈間距離擴(kuò)大,ICA-WYS,,,,抗原免疫原性必要條件AD外露在分子表面(與抗體結(jié)合的只是抗原分子表面的AD )BSA含18個(gè)AD，暴露在分子表面與抗體特異性結(jié)合的只有6個(gè)。BSA酶解后，內(nèi)部AD暴露出來，成為新生的 AD，

9、可引起免疫反應(yīng),ICA-WYS,,,ICA-WYS,不同化學(xué)基團(tuán)決定抗原抗體反應(yīng)專一性Landsteiner用馬血清白蛋白分別偶聯(lián)苯胺類物質(zhì)組成偶氮蛋白質(zhì)。然后用所制偶氮蛋白質(zhì)作抗原分別免疫家兔得到相應(yīng)抗血清這些抗血清只能與相應(yīng)抗原起反應(yīng)說明不同化學(xué)基團(tuán)決定抗原抗體反應(yīng)的專一性,ICA-WYS,,,化學(xué)組成和性質(zhì),ICA-WYS,*,,,,,,,,蛋白質(zhì)中Tyr殘基,偶氮苯磺酸蛋白質(zhì)（抗原）,ICA-WYS,,,ICA-WYS,表

10、2-1 不同化學(xué)基團(tuán)對(duì)抗原特異性的影響,ICA-WYS,,,ICA-WYS,,構(gòu)型與構(gòu)象 AD特異性與抗原分子上化學(xué)基團(tuán)空間構(gòu)型與有關(guān)氨基苯甲酸鄰、間、對(duì)位異構(gòu)物分別與同種蛋白偶聯(lián)后，經(jīng)分別免疫動(dòng)物得3種抗體，它們只能與相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng)AD的特異性與抗原光學(xué)構(gòu)型有關(guān)左旋和右旋酒石酸分別與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后，經(jīng)免疫動(dòng)物獲得的抗體，只能與相應(yīng)的左旋或右旋酒石酸發(fā)生特異反應(yīng)。,ICA-WYS,,,ICA-WYS,表2-2 化學(xué)基團(tuán)位置對(duì)

11、抗原特異性的影響,抗體 半抗原（抗半抗原-載體 苯胺 鄰氨基 間氨基 對(duì)氨基 免疫血清） 苯甲酸 苯甲酸 苯甲酸 抗載體-苯胺 ++++ — — —抗載體-鄰氨基苯甲酸

12、— ++++ — —抗載體-間氨基苯甲酸 — — ++++ —抗載體-對(duì)氨基苯甲酸 — — — ++++,,,,,,ICA-WYS,,,ICA-WYS,AD特異性與其構(gòu)象有關(guān) Sela 合成2種有不同構(gòu)象的三肽聚合物：TAG-L：Tyr-Ala-Glu 三肽連在多聚Ala和多聚Lys叉

13、鏈骨架上（無規(guī)則螺旋結(jié)構(gòu)）(TAG)n：α-螺旋構(gòu)象的Tyr-Ala-Glu聚合物這兩種多聚物分別免疫家兔所產(chǎn)生的抗體，在免疫學(xué)上無交叉反應(yīng),ICA-WYS,,,ICA-WYS,分子量7.5x104無規(guī)則螺旋結(jié)構(gòu)多聚物,(Tyr-Ala-Glu)n,分子量1.0x105α –螺旋構(gòu)象聚合物,,,ICA-WYS,ICA-WYS,TAG-L抗原性取決于氨基酸序列，稱序列決定簇 (sequential determinant) (

14、TAG)n 抗原性取決于分子構(gòu)象，稱構(gòu)象決定簇(conformational determinant)溶菌酶分子5個(gè)AD，3個(gè)是構(gòu)象AD 改變AD氨基酸序列或破壞蛋白質(zhì)構(gòu)象，其專一性也隨之改變,ICA-WYS,,,,ICA-WYS,ICA-WYS,,,1.表位預(yù)測方法適于已知一級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽抗原預(yù)測 (1)親水性方案(Hydrophilicity)蛋白抗原各氨基酸殘基分為親水和疏水殘基兩類疏水性殘基一般埋在蛋白內(nèi)部,

15、親水性殘基位于表面,親水部位與抗原表位有密切聯(lián)系,（二）蛋白質(zhì)抗原表位分析方法,,ICA-WYS,ICA-WYS,,,(2)抗原性方案(Antigenicity)抗原性刻度（Welling）各氨基酸用出現(xiàn)在抗原區(qū)頻率描述, 此頻率除以各氨基酸在所有蛋白質(zhì)中的頻率就可推出此刻度值疏水性氨基酸殘基對(duì)抗原表位形成亦有貢獻(xiàn)缺點(diǎn):所用數(shù)據(jù)庫有限,并且連續(xù)位點(diǎn)內(nèi)的殘基被認(rèn)為是同等重要,,ICA-WYS,ICA-WYS,,,(3)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測方

16、案(Secondary structure) β轉(zhuǎn)角為凸出結(jié)構(gòu),多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面, 利于與抗體嵌合, 較可能成為抗原表位α螺旋、β片層結(jié)構(gòu)規(guī)則不易形變, 較難嵌合抗體,一般不作為抗原表位預(yù)測成功率均不超過65%。Cohen方法對(duì)轉(zhuǎn)角的預(yù)測正確率很高, 對(duì)于已知折疊類型的蛋白質(zhì)(αα類, ββ類,α/β類) 正確率高達(dá)95%,,ICA-WYS,ICA-WYS,,,2. 化學(xué)“切割”法或酶法① 化學(xué)法或酶“切割”抗原, 分離抗

17、原肽段, 研究其與不同McAb的作用, 確定抗原表位該法對(duì)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)不作要求, 測定結(jié)果只能是抗原的線性表位,,ICA-WYS,ICA-WYS,,,②水解抗原-抗體復(fù)合物直接確定線性及構(gòu)象性抗原表位方法, 又稱蛋白質(zhì)足跡分析( Protein footprinting) 理論依據(jù):抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合部位能抵抗蛋白酶水解采用質(zhì)譜技術(shù)已成功確定細(xì)胞色素C , 胃泌素釋放肽(GRP) , 脂堿性磷酸酶( PLAP) 等抗原表位

18、Lemmel C, Stevanovi? S. The use of HPLC-MS in T-cell epitope identification. Methods 29 (2003) 248 ~259,,ICA-WYS,抗原結(jié)合價(jià)（antigenic valence ）,能和抗體分子結(jié)合的AD數(shù)目。半抗原為一價(jià)，天然抗原一般是大分子，由多種、多個(gè)AD組成，是多價(jià)抗原，可和多個(gè)抗體分子結(jié)合,ICA-WYS,,,抗原結(jié)合價(jià)（抗原價(jià)）

19、指能與抗體分子結(jié)合的AD總數(shù)分子量10萬：2個(gè)抗原價(jià)分子量40萬：10~12個(gè)抗原價(jià)一個(gè)含100個(gè)氨基酸的球型蛋白可能只有幾個(gè)表面AD，因蛋白質(zhì)空間折疊使大部分AD埋藏于分子內(nèi)部,ICA-WYS,,,ICA-WYS,交叉反應(yīng)Ag除與相應(yīng)Ab發(fā)生特異性反應(yīng)外，有時(shí)還可與其它Ab或Ag發(fā)生反應(yīng)，稱為交叉反應(yīng)（cross reaction）因兩種AD在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有部分相似肺炎莢膜多糖3型(S3)與8型 (S8)均含有纖維二糖醛酸

20、殘基結(jié)構(gòu)，有一定相似性，故與馬抗S3血清或馬抗S8血清相遇時(shí)，兩者均出現(xiàn)一定程度的交叉反應(yīng),ICA-WYS,,,ICA-WYS,肺炎莢膜多糖S3 型與S8型的結(jié)構(gòu)式：,ICA-WYS,S3,S8,纖維二糖醛酸殘基,纖維二糖醛酸殘基,纖維二糖醛酸殘基,葡萄糖半乳糖殘基,,,ICA-WYS,30,四、抗原結(jié)構(gòu)的免疫化學(xué),（一）蛋白質(zhì)抗原鯨肌紅蛋白結(jié)構(gòu) 1條153個(gè)氨基酸殘基多肽鏈+1個(gè)血紅素輔基 8個(gè)螺旋區(qū)（α-螺旋占75%） 肽

21、鏈轉(zhuǎn)彎處形成無規(guī)卷曲（α-螺旋不能轉(zhuǎn)彎）AD處于肽鏈第16~ 21、56~62、94~99、113~ 119與146~151位氨基酸殘基的各位點(diǎn)上,ICA-WYS,,,ICA-WYS,圖2-4 肌紅蛋白的構(gòu)象,ICA-WYS,,,F8,E7,A,B,C,D,E,F,G,H,ICA-WYS,圖2-5 鯨肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖,,ICA-WYS,,,,16~21,,56~62,94~99,113~119,146~151,ICA-WYS,

22、ICA-WYS,,,,,表2-2 鯨肌紅蛋白抗原決定簇位點(diǎn)的一級(jí)結(jié)構(gòu),決定簇位點(diǎn) 氨基酸殘基及位置 殘基數(shù),15 16 21 22 1 (Ala)-Lys-Val-Glu-Ala-Asp-Val-(Ala) 6或7 56

23、 622 Lys-Ala-Ser-Glu-Asp-Leu-Lys 7 94 99 3 Ala-Thr-Lys-His-Lys-Ile 6 113

24、 119 4 His-Val-Leu-His-Ser-Arg-His 7 145 146 151 5 (Lys)-Tyr-Lys-Glu-Leu-Gly-Tyr 6或7,表2-4 鯨肌紅蛋白抗原決定簇位點(diǎn)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定簇位點(diǎn)

25、 氨基酸殘基及位置 殘基數(shù) 15 16 21 22 1 (Ala)-Lys-Val-Glu-Ala-Asp-Val-(Ala) 6或7 56

26、 62 2 Lys-Ala-Ser-Glu-Asp-Leu-Lys 7 94 99 3 Ala-Thr-Lys-His-Lys-Ile

27、 6 113 119 4 His-Val-Leu-His-Ser-Arg-His 7 145 146 151 5

28、 (Lys)-Tyr-Lys-Glu-Leu-Gly-Tyr 6或7,,,,ICA-WYS,AD位點(diǎn)分布 分子表面突出部位肽鏈轉(zhuǎn)角處或末端、兩個(gè)α-螺旋區(qū)域之間大小與抗體分子抗原結(jié)合部位大小相符AD中氨基酸類型分析 Lys (AD1、2、3、5)、 Arg(4)、Glu (1、2、5)、Asp (1、2)、His (3、4)，均有極性基團(tuán)與抗體結(jié)合，極性基團(tuán)發(fā)揮抗原活性作用？,

29、ICA-WYS,,,,ICA-WYS,（二）多糖抗原,AD: 糖鏈非還原性端高度分支比直鏈多糖有較多ADKabat 用抗原性細(xì)菌多糖測抗體分子抗原結(jié)合部位大小 葡聚糖（dextran）和果聚糖（levan） 作探針,ICA-WYS,,,ICA-WYS,方法用葡聚糖和抗葡聚糖血清反應(yīng)，由葡糖單位形成的二糖、三糖……七糖等進(jìn)行沉淀抑制反應(yīng)，以測定抗體分子抗原結(jié)合部位大小可溶性Ag與相應(yīng)Ab特異結(jié)合，在二者比例合適、并有一定濃度電解

30、質(zhì)存在時(shí)，可形成不溶性免疫復(fù)合物(IC)沉淀當(dāng)抗原過量時(shí)，形成IC分子小，會(huì)發(fā)生解離,ICA-WYS,,,ICA-WYS,抑制劑濃度,抑制百分率,,,圖2-5 葡聚糖、抗葡聚糖與低聚糖間的沉淀抑制反應(yīng) 注：3為丙糖，4為丁糖，5為戊糖，6為己糖,ICA-WYS,生物標(biāo)志物（biomarker）定義：能反映致病因素或毒物從暴露到效應(yīng)過程各個(gè)環(huán)節(jié)性質(zhì)的特異性生物分子如DNA加合物、蛋白質(zhì)加合物等用生物標(biāo)志物作為環(huán)境污染物暴

31、露及毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)、預(yù)警，是當(dāng)前研究熱點(diǎn),ICA-WYS,,,參考文獻(xiàn)：余建新，吳采櫻。生物標(biāo)志物用于污染物的快速檢測及毒性評(píng)價(jià)。分析化學(xué)，2002，30（1）：107~113,ICA-WYS,常見腫瘤標(biāo)志物,甲胎蛋白 - AFP癌胚抗原 - CEA卵巢癌相關(guān)抗原 – CA125乳腺癌相關(guān)抗原 – CA15-3癌癥相關(guān)抗原 – CA72-4癌癥相關(guān)抗原 – CA50前列腺癌特異抗原 – PSA,ICA-WYS,,,癌胚抗原（

32、carcinoembryonic antigen; CEA） 廣譜性腫瘤標(biāo)志物對(duì)大腸癌、乳腺癌和肺癌療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測和預(yù)后估計(jì)是一個(gè)較好的腫瘤標(biāo)志物 CEA is a widely distributed tumour marker. Although it is expressed in high proportions on a variety of human tumours, notably of the colo

33、n but also of the breast and lung, studies also reveal the presence of CEA in normal tissues.,ICA-WYS,,,正常成人血液CEA很難檢出70-90%結(jié)腸腺癌患者CEA高度陽性，胃癌（60-90％）、胰腺癌（70-80％）、小腸腺癌（60-83％）、肺癌（56-80％）、肝癌（62-75％）、乳腺癌（40-68％）、泌尿系癌腫（31-46％

34、） CEA含量與腫瘤大小、有無轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)系，發(fā)生肝轉(zhuǎn)移時(shí)，CEA升高尤為明顯,ICA-WYS,,,術(shù)前或治療前CEA濃度能預(yù)示腫瘤狀態(tài)、存活期及有無手術(shù)指征等術(shù)前CEA濃度低，說明病期早，腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)可能越小，其生存時(shí)間越長；療效觀察手術(shù)完全切除者，術(shù)后6周CEA回復(fù)正常；術(shù)后有殘留或微轉(zhuǎn)移者，可見下降，但不恢復(fù)正常；無法切除者，一般呈持續(xù)上升CEA濃度隨治療而下降，說明有效；若經(jīng)治療其濃度不變，甚至上升，則須更換治療方

35、案,ICA-WYS,,,結(jié)構(gòu)糖蛋白，分子量約20萬。不同腫瘤提取CEA, 抗原性相似，所含唾液酸及糖組分含量不一定相同，有多個(gè)抗原表位 A highly glycosylated cell surface protein of molecular mass about 180,000. The primary structure：the mature CEA (starting at Lys) consists of 668 a

36、mino acids, with the first 643 being extracellular.,ICA-WYS,,,The extracellular region consists of seven domains, each having sequence similarity with immunoglobulin (Ig) domains, thus CEA is a member of the Ig superfami

37、ly . We report the prediction for each of the seven extracellulat domains based on multiple sequence alignments , and a knowledge-based approach for fragment fitting. P. A. Bates, J. Luo, M.J.E. Sternberg, FEBS LETTERS

38、, 1992, 301(2):207-214,ICA-WYS,,,Fig. 5. A ribbon diagram of the first three domains of CEA showing the postulated packing arrangemcnt. The complete molecule due to rotation and translation of the A and B repeats, woul

39、d be rod-like in appearance.,ICA-WYS,,,Fig. 6. Diagrammatic sketch of N-domain of CEA. The sketch was adapted from Bates et al. T. Nasu, Y. Fukuda, J. Hashino, K. Nagahira, H. Kawashima, C. Noguchi, S. Oikawa, T. Nakani

40、shi, Immunology Letters, 1999, 67: 57–62.,ICA-WYS,,,Label-Free Detection of a Biomarker with Piezo- electric Micro Cantilever Based on Mass Micro BalancingYeolho Lee, Sangkyu Lee, Hyejung Seo, Sangmin Jeon, and Wonkyu M

41、oon*, JALA, 2008;13:259–64.,Figure 6. Detection procedures of carcinoembryonic antigen by antigen-antibody bind.,ICA-WYS,,,L. Wang, B. Liu, H. Yin, J. Wei, X. Qian, L. Yu, Selection of DNA aptamer that specific binding h