特異性標(biāo)記MHCⅠ類分子的新型方法研究.pdf

1、目的:采用位點(diǎn)特異性熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)建立新型示蹤MHC-I類分子的方法,并比較不同標(biāo)簽在體細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞中示蹤MHC-I類分子的優(yōu)缺點(diǎn)。
　　方法:(1)構(gòu)建H-2Kb-EGFPTCtag和H-2Kb-TCtag真核慢病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞制備病毒H-2Kb-EGFPTCtag和H-2Kb-TCtag,將病毒分別感染體細(xì)胞293FT和樹突狀細(xì)胞系DC2.4細(xì)胞后,分別采用染料ReAsH和FlAsH染色,在激光共聚焦顯

2、微鏡下觀察H-2Kb的分布情況;(2)H-2Kb-TCtag轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,采用染料 ReAsH染色,在激光共聚焦顯微鏡下觀察 H-2Kb的分布情況;(3)構(gòu)建 H-2Kb-halotag融合蛋白的真核慢病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞制備病毒,將病毒分別感染體細(xì)胞293FT、樹突狀細(xì)胞系 DC2.4細(xì)胞以及DC2.4-FUKY細(xì)胞后,采用染料HaloTag TMR染色,在激光共聚焦顯微鏡下觀察H-2Kb的分布情況;(4)構(gòu)建H-2

3、Kb-halotagout融合蛋白的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,采用染料HaloTag?Alexa488染色,在熒光顯微鏡下觀察293FT細(xì)胞膜上的H-2Kb的表達(dá)分布。
　　結(jié)果:(1)在激光共聚焦顯微鏡下觀察到了在293FT細(xì)胞中kb-EGFP-Tctag融合蛋白與ReAsH染色的kb-Tctag融合蛋白、kb-EYFP-halotag與染料HaloTag? TMR都是是共定位的,證明了Tctag與染料ReAsH、kbh

4、alotag與染料HaloTag? TMR是特異性結(jié)合,并且都不會影響kb的分布表達(dá);(2)在激光共聚焦顯微鏡下觀察到了在非APC細(xì)胞293FT細(xì)胞中,tctag和halotag都是特異性標(biāo)記MHC I類分子;(3)在激光共聚焦顯微鏡下觀察到了在APC細(xì)胞DC2.4細(xì)胞中,tctag是非特異性標(biāo)記MHC I類分子,而halotag是特異性標(biāo)記MHC I類分子的;(4)在熒光顯微鏡下觀察到293FT細(xì)胞膜上的H-2Kb的表達(dá)分布。