小鼠精原干細(xì)胞新特異性標(biāo)記物的確定.pdf

1、目的：近年來男性不育率呈逐年上升趨勢，世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計結(jié)果顯示全世界不孕不育癥患病率約為10％-15%，其中因為男性不育因素的比例已經(jīng)占到了一半。人類精液的質(zhì)量和精子數(shù)量下降是造成男性不育的最主要原因。目前，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，環(huán)境污染、遺傳、毒物、藥物等多種因素的不斷作用，地球稀有物種數(shù)量不斷減少、滅絕，雄性動物生殖能力不斷下降，最新研究證實，各種化學(xué)污染正讓包括人類的雄性動物雌性化，損害雄性生殖器官和生殖力，雄性已演化成為弱

2、勢族群，岌岌可危，勢必對人類和野生動植物帶來難以估量的后果。世界衛(wèi)生組織預(yù)言男性不育癥、癌癥、心血管疾病將成為21世紀(jì)危害人類健康最嚴(yán)重的三大疾病。精子深低溫凍存是唯一一種通過生殖扶育手段維持男性生育能力的方法，包括卵泡漿內(nèi)單精子注射技術(shù)和圓形精子注射技術(shù)。但其成功率特別低，僅達(dá)到25%左右。在無精癥患者中，非梗阻性無精癥患者占到60%，對于成熟精子的獲取顯得異常困難。為此如何保護雄性動物包括人類在內(nèi)的的生殖能力成了擺在當(dāng)今科學(xué)界面前的

3、重要任務(wù)、精原干細(xì)胞移植技術(shù)就是在這樣的一個大背景下誕生的具有前沿性的生命技術(shù)，該技術(shù)是從適齡雄性供體動物采集精原干細(xì)胞，注射入適齡受體動物的生精小管中使其產(chǎn)生精子的技術(shù)。隨著這項技術(shù)的不斷深入研究,精原干細(xì)胞不但可以在同種間進行移植,而且在異種間的移植也獲得成功。通過對培養(yǎng)體系的不斷完善，篩選、移植方法的不斷改進,可以獲得更高的移植成功率。精原干細(xì)胞移植技術(shù)應(yīng)用的前提是利用特異性的標(biāo)志物在眾多細(xì)胞中快速高效的提取目的干細(xì)胞，并將其移入

4、到受體組織中。精原干細(xì)胞移植為提高優(yōu)良品種家畜的生產(chǎn)效率、保護野生動物資源、轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)及不育癥的治療提供了一種新的方法。目前國際、國內(nèi)已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的精原干細(xì)胞標(biāo)志物多達(dá)10余個，但均缺乏特異性。本研究就是為了尋找更好的精原干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物并觀察其在各年齡階段的動態(tài)表達(dá)。
　　方法：前期利用iTRAQ蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)觀測各年齡階段精原干細(xì)胞蛋白標(biāo)志物表達(dá)的動態(tài)變化，運用生物信息學(xué)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫篩選并發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志物（P63

5、、CD71、CD98、ALDH2、E-cadherin、PLZF）。依據(jù)在出生后6天小鼠睪丸內(nèi)性原細(xì)胞發(fā)育為精原干細(xì)胞，以正常雄性C57BL/6小鼠為研究對象，按照年齡段不同隨機分組如下：出生1-6天、出生7-14天、出生15-21天、出生22-28天、出生29-35天、出生36-42天、出生43-49天、出生50天以上（共8組），每組6只。首先免疫組織化學(xué)染色方法檢測以上蛋白在小鼠各年齡段的睪丸中的表達(dá)情況，若蛋白在睪丸中的表達(dá)具有特

6、異性，用免疫熒光雙標(biāo)法檢測新標(biāo)記物的表達(dá)位置，采用已知的SSCs標(biāo)記物（CD90）做對照，用新發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記物在小鼠的各個階段進行免疫組織熒光雙標(biāo)，來定位新標(biāo)記物是否在SSCs表達(dá)。應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測新標(biāo)記物在小鼠各階段基因水平的表達(dá)量，用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（western blot）檢測新標(biāo)記物在小鼠的各個階段蛋白水平的表達(dá)量。
　　結(jié)果：免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，P63蛋白在各年齡段小鼠睪丸中的表達(dá)不具有特異性，在生精小管中散在的

7、陽性表達(dá)；E-cadherin蛋白在各年齡段小鼠睪丸中基底膜處細(xì)胞陽性表達(dá)，且在生精小管其他位置也有陽性表達(dá)；CD98蛋白在各年齡段小鼠睪丸中的表達(dá)不具有特異性，在生精小管中散在的陽性表達(dá)；CD71蛋白同樣在各年齡段小鼠睪丸中的表達(dá)不具有特異性，在生精小管中散在的陽性表達(dá)；ALDH2蛋白不在小鼠各年齡段細(xì)胞上表達(dá)，在小鼠間質(zhì)細(xì)胞中陽性表達(dá)。這5個蛋白表達(dá)沒有特異性。PLZF蛋白在小鼠各年齡段表達(dá)且具有細(xì)胞特異性。
　　結(jié)論：P63