血痕特異性mRNA及microRNA標(biāo)記的研究.pdf

1、血痕是法醫(yī)物證中最常見的檢材，也是法醫(yī)物證檢驗(yàn)中最常遇到和最重要的項(xiàng)目。目前常用的血痕檢驗(yàn)的主要方法包括：生物化學(xué)方法、細(xì)胞學(xué)方法以及免疫學(xué)方法。這些方法都存在一定的局限性，如特異度不高、靈敏度較低、容易出現(xiàn)假陰或假陽性、不適合微量檢材等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的法醫(yī)學(xué)研究者從基因表達(dá)水平探討了血痕確證的新方法。
　　 目的：
　　 1.探討并驗(yàn)證HBA和SPTB基因mRNA的組織特異性及其在法醫(yī)血痕確證中的

2、應(yīng)用價(jià)值。
　　 2.探討并驗(yàn)證miR451和miR16基因的組織特異性及其在法醫(yī)血痕確證中的應(yīng)用價(jià)值。
　　 3.建立基于目前法醫(yī)DNA分析技術(shù)平臺(tái)的血痕確證方法，并就其特異性、靈敏度及穩(wěn)定性三個(gè)方面與抗人血紅蛋白膠體金試紙進(jìn)行比較。
　　 方法：
　　 1.RNA提取方法的研究：選取6個(gè)新鮮血痕樣本，分別用TRIzol法和硅膠柱純化法提取RNA，通過紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳對提取的RNA定量和檢

3、測其完整性，選取適合本實(shí)驗(yàn)的RNA提取方法。并用Trizol法同時(shí)提取DNA，對DNA進(jìn)行STR分型檢測。
　　 2.血痕HBA及SPTB mRNA的特異性研究：收集120份人靜脈血樣(新鮮血痕30份，陳舊血痕90份)，6種動(dòng)物(狗、兔、小鼠、雞、貓、猴)的血痕樣本各1份，精液斑10份、月經(jīng)血痕10份、陰道液斑10份。在NCBI Date Base上查找HBA、SPTB和ACTB的mRNA序列，利用Primer Express(

4、R)2.0軟件設(shè)計(jì)引物及TaqMan探針，并將設(shè)計(jì)好的引物序列導(dǎo)入BLAST軟件，以檢驗(yàn)引物的特異性。利用RT-qPCR法對所有樣本檢測其HBA和SPTB的△CT，并評估其在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用價(jià)值。
　　 3.血痕miR16及miR451microRNA的特異性研究：利用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對120份人靜脈血痕進(jìn)行隨機(jī)抽樣，選取60份為microRNA樣本，利用RT-qPCR法對60份血痕、6種動(dòng)物血、6份陰道液斑、6份精液

5、斑檢測其miR451和miR16的△CT，并評估其在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用價(jià)值。
　　 4.體液斑特異性mRNA標(biāo)記的復(fù)合檢測：對ACTB、HBA、MMP7、MMP11、KLK3和PRM2標(biāo)記FAM熒光并建立復(fù)合擴(kuò)增體系，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)-銀染法和毛細(xì)管熒光電泳法檢測特異性擴(kuò)增片段。
　　 5.抗人血紅蛋白金標(biāo)試紙的評估：用抗人血紅蛋白金標(biāo)試紙對不同動(dòng)物血痕、陳舊血痕、逐級稀釋的血液檢測，并與HBA、SPTB、

6、miR451和miR16比較。
　　 結(jié)果：
　　 1.RNA提取方法的選擇：TRIzol法提取的RNA質(zhì)量優(yōu)于硅膠柱純化法，對Trizol法同時(shí)提取DNA進(jìn)行STR分型檢測，可以得到理想的STR分型圖譜。
　　 2.血痕特異性mRNA標(biāo)記檢測體系：
　　 (1)設(shè)定HBA閾值為0.2，陽性標(biāo)準(zhǔn)為ACTB CT≤35，HBACT≤38且△CT≤-5。對30份新鮮血痕進(jìn)行檢測，陽性率為97％。在10份陰道液

7、和10份精液未見陽性，組織特異性好。HBA在6份動(dòng)物血痕均可檢測出CT值，但可以根據(jù)陽性標(biāo)準(zhǔn)與人血區(qū)分。在1μL血液或2ng的RNA模板均可檢出HBA。對保存時(shí)間為3個(gè)月內(nèi)的血痕CT值變化較大，6個(gè)月以上的血痕樣本的CT值趨于穩(wěn)定。
　　 (2)設(shè)定SPTB閾值為0.05，陽性標(biāo)準(zhǔn)為ACTB CT≤35，SPTB CT≤40且4≤△CT≤13，對30份新鮮血痕進(jìn)行檢測，陽性率為60％。10份陰道液和10份精液假陽性率為30％。在

8、動(dòng)物血痕中未見陽性。對100μL血液或2ng的RNA模板均可檢出SPTB。CT值在不同保存時(shí)間樣本中變化較小，CT值介于39～41之間。
　　 3.血痕特異性microRNA標(biāo)記檢測體系：
　　 (1)設(shè)定miR16的閾值為0.2，陽性標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為RNU6b CT≤40，miR16 CT≤35且△CT≤-13。對15份新鮮血痕進(jìn)行檢測，陽性率為73％；6份精液和6份陰道液中未見陽性檢出，6種動(dòng)物血中假陽性率為17％。對100

9、μL血液或68ng的RNA模板均可檢出miR16。在保存20年的血痕中仍有miR16表達(dá)。
　　 (2)設(shè)定miR451的閡值設(shè)為0.2，陽性標(biāo)準(zhǔn)為RNU6b CT≤40，miR451 CT≤37且△CT≤-12。對15份新鮮血痕進(jìn)行檢測，陽性率為53％；6份精液和6份陰道液中未見陽性；6份動(dòng)物血中假陽性率為33％。對100μL血液或68ng的RNA模板均可檢出miR451。在保存20年的血痕中仍有miR451表達(dá)。
　　

10、 4.體液斑復(fù)合擴(kuò)增體系：以HBA mRNA為血痕特異性標(biāo)記，與精液和月經(jīng)血的特異性mRNA標(biāo)記和內(nèi)參基因mRNA標(biāo)記進(jìn)行復(fù)合檢測。在不同體液斑的特異性片段擴(kuò)增產(chǎn)物位置有相應(yīng)產(chǎn)物，組織特異性好。猴血中可以檢測到HBA和ACTB擴(kuò)增片段，其他動(dòng)物血中均無HBA和ACTB擴(kuò)增片段檢出。設(shè)HBA的RFUs值＞200為陽性，單獨(dú)擴(kuò)增時(shí)HBA在1×10-4μL血液和2×10-2ng RNA中仍可檢測到擴(kuò)增片段并達(dá)到陽性標(biāo)準(zhǔn)；復(fù)合擴(kuò)增時(shí)在1μL血

11、液和20ng的RNA模板均可檢出HBA。在保存3個(gè)月內(nèi)的血痕中檢出HBA。
　　 5.抗人血紅蛋白膠體金試紙的結(jié)果：猴血抗人血紅蛋白膠體金試紙?jiān)囼?yàn)呈陽性反應(yīng)。可檢測到的最低血液濃度為1×10-4μL。對于10年內(nèi)的陳舊血痕可呈陽性反應(yīng)。
　　 結(jié)論：
　　 1.HBA可作為血痕特異性mRNA標(biāo)記用于血痕確證，但不適用于常溫下保存時(shí)間超過3個(gè)月的血痕確證。
　　 2.SPTB種屬特異性低、組織特異性低及在血

12、痕中含量不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，不建議將SPTB作為血痕特異性mRN A標(biāo)記用于血痕確證。
　　 3.miR16和miR451可作為血痕特異性microRNA標(biāo)記用于血痕確證。
　　 4.毛細(xì)管熒光電泳通過檢測復(fù)合擴(kuò)增產(chǎn)物可以同時(shí)檢測多種體液斑，是基于現(xiàn)有DNA分型技術(shù)確證體液斑的有效方法。
　　 5.HBA、miR16和miR451可聯(lián)合用于陳舊血痕的確證。
　　 6.抗人血紅蛋白膠體金試紙?jiān)诤镅赎栃越Y(jié)果，在靈