結(jié)核分枝桿菌新人T細胞表位及特異性蛋白的抗原性研究.pdf

1、結(jié)核病（tuberculosis，TB）是一種由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引發(fā)的嚴重危害人類健康的慢性呼吸道傳染病。近些年來，由于耐多藥結(jié)核病（MDR-TB）和廣泛耐藥結(jié)核?。╔DR-TB）的流行及MTB與人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）共同感染等原因，古老的結(jié)核病再次成為全球面臨的嚴峻的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一。然而，目前診斷結(jié)核病的金標準依

2、然是羅氏固體培養(yǎng)，尚無有效、快速診斷結(jié)核病的方法。同時，研究已證實BCG的保護效果不理想，特別是對成年人結(jié)核幾乎無預防效果。結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白及其抗原表位的研究，在開發(fā)結(jié)核病新型診斷方法和研究有效的結(jié)核病新疫苗中具有著重要的作用。
　　本研究采用兩種方法開展了結(jié)核分枝桿菌特異性抗原及人 T細胞表位的研究，以期發(fā)現(xiàn)最佳的新T細胞抗原，為后續(xù)診斷試劑和疫苗研究提供基礎。一方面采用生物信息學方法，排除PE/PPE家族蛋白、轉(zhuǎn)座子及已

3、知抗原表位，對余下的所有蛋白進行系統(tǒng)、全面的人T細胞表位預測，并從中篩選優(yōu)勢表位進行生物合成。合成的表位，采用酶聯(lián)免疫反應斑點法（ELISPOT）進行初步及擴大樣本量兩步驗證。同時對表位集中的預測抗原及已知表位信息的特異性抗原，根據(jù)其編碼基因序列設計引物，分子克隆方法獲得重組質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化入原核表達系統(tǒng)進行表達，經(jīng)Ni親和柱親和層析方法純化，得到各重組蛋白。若重組蛋白為包涵體表達形式，采用透析復性以恢復天然構(gòu)象。最后，建立最佳血清及抗原濃

4、度的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法，初步評價重組蛋白的抗原性。
　　利用TEPredict和IEDB兩個軟件同時預測出了273個抗原蛋白的2726個表位，從中篩選出評分大于5的50個表位，主要分布于Rv1798、Rv0197、Rv0658c、Rv2942及Rv3239c5個抗原。經(jīng)進一步表位優(yōu)化，獲取分布于5個抗原上的32條多肽，由生物公司合成并純化。采集結(jié)核病人血，分離得到外周血單個核細胞（PBMC），ELISPOT方法進行

5、初步篩選。經(jīng)10個細菌學陽性病人血樣本對每條多肽的篩選，獲得6條陽性多肽。對于陽性肽再使用50個細菌學陽性的結(jié)核病人及60個肺部病人和60個健康人作為對照進行驗證。單條肽Rv1798-1、Rv1798-2、Rv0197、Rv0658c、Rv2942、Rv3239c的靈敏度分別為12.0％、18.0%、20.0%、8.0%、10.0%、4.0%，特異度均在99%以上。抗原Rv1798兩條多肽聯(lián)合靈敏度為24.0%，而特異度達到100%。由

6、此可見，多肽聯(lián)合用于結(jié)核病的診斷價值，遠遠高于單條多肽。
　　同時，我們選擇了10個特異性蛋白抗原進行分子克隆及原核表達。本研究成功構(gòu)建了相應抗原的重組質(zhì)粒，表達純化得到GroES、LpqH、PstS3、PPE18、PPE19、GlnA1、PlcA和EccA58種重組蛋白（其中兩個重組質(zhì)粒未表達成功）。進一步采用ELISA方法評價了這些蛋白在血清學中的診斷價值?？乖璆roES、PPE18、PPE19、GlnA1及EccA5的診斷價

7、值較高，曲線下面積（AUC）大于80%，其中靈敏度分別為72.1%、76.8%、59.0%、66.8%、66.8%，特異度分別為81.4%、78.4%、92.2%、78.4%、83.3%。抗原LpqH、PstS3和PlcA的AUC也均大于70%，其靈敏度分別為66.3%、52.1%、75.3%，特異度分別為68.6%、88.2%、65.7%。
　　綜上所述，本研究首次采用TEPredict和IEDB兩個軟件同時對結(jié)核分枝桿菌毒力相