抗原85B特異性氨基酸序列質(zhì)譜檢測在鑒別診斷結核與非結核分枝桿菌感染中的價值.pdf

1、目的:目前全球范圍內(nèi)非結核分枝桿菌(nontuberculousmycobacteria，NTM)的感染持續(xù)增多，而NTM與結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，Mtb)的治療方案及療程差別很大，因此有必要將Mtb與NTM區(qū)分開。然而，由于Mtb與NTM的臨床及肺部影像學、痰涂片表現(xiàn)相似，且痰培養(yǎng)耗時較長，因此，早期快速區(qū)分二者非常困難。許多新的NTM檢測技術越來越多的被研究，如:基于核酸擴增的DNA檢測技

2、術，酶聯(lián)免疫吸附試驗等血清學診斷方法等，但這些方法用于NTM的鑒定仍處于初級階段。
　　抗原85(Antigen85，Ag)復合物(Ag85A，Ag85B，Ag85C)是主要的結核分枝桿菌分泌抗原，分子量30-32KD，作為分枝?；D移酶在細胞壁合成中起到了重要作用。Ag85B首先在Mtb中鑒定，但在多種NTM中表達。通過酶免疫分析方法，結核Ag85B蛋白抗原或抗體已在血清、痰、腦脊液中被檢測到，由于各分枝桿菌的Ag85蛋白間具有

3、高度氨基酸序列同源性，蛋白質(zhì)結構及功能亦相似，通過傳統(tǒng)的免疫學方法難以區(qū)分，尚未見Ag85B在應用于診斷NTM的報道。
　　為了早期、準確的鑒別NTM及Mtb感染，并判斷病情活動性，我們進行了本研究。在本實驗中，可以通過HPLC-MS/MS識別氨基酸序列，檢測Mtb或NTM感染病人的痰分枝桿菌培養(yǎng)上清或血清中的菌種特異性Ag85B目標肽段，從而研究其在臨床分枝桿菌感染鑒別診斷及判斷結核病活動性中的價值及臨床意義。
　　研究方

4、法:1、分枝桿菌Ag85B蛋白序列同源性分析與MtbAg85B蛋白標準品胰酶酶切分析，以選取菌種特異性目標肽段
　　通過分枝桿菌Ag85B蛋白序列比對結合Mtb Ag85B蛋白的理論胰酶酶切，選擇可區(qū)分Mtb與NTM潛能的片段做為目標肽段。繼之在Mtb Ag85B蛋白標準品胰酶酶切液中，驗證目標肽段。
　　2、應用液相色譜分析在分枝桿菌標準菌株培養(yǎng)上清中驗證菌種特異性Ag85B目標肽段，并建立血清中Ag85B檢測方法學

5、>　　應用強陽離子交換柱，除鹽純化富集胰酶消化的分枝桿菌培養(yǎng)上清中的肽，通過HPLC-MS/MS數(shù)據(jù)依賴性獲取(DDA)模式，分析分枝桿菌培養(yǎng)液上清中Ag85B蛋白酶切片段組成。通過液相色譜儀平行反應監(jiān)視(PRM)模式，掃描分枝桿菌培養(yǎng)液上清中菌種特異性Ag85B目標肽段，以提高信號強度及檢測敏感性。最后通過模擬血清Mtb Ag85B標準抗原抗體結合、解離及Ag85B富集、酶切，建立液相色譜檢測血清Ag85B的方法學。
　　3、在

6、臨床Mtb與NTM病人痰或血清樣品中檢測菌種特異性Ag85B目標肽段
　　采用HPLC-MS/MS分析PRM模式，在一次運行中檢測如下臨床樣品中Mtb或NTM菌種特異性Ag85B目標肽段:87例肺結核病人、34例肺鳥-胞內(nèi)分枝桿菌感染(MAC)病人、21例肺堪薩斯(M.kansasii)感染病人痰及血清標本;38例結核性胸膜炎病人（無痰或痰結核菌培養(yǎng)陰性）、41例肺外結核病人、48例潛伏性結核感染病人血清及36例健康對照者的血清樣

7、品。肺分枝桿菌感染病人經(jīng)痰培養(yǎng)陽性確證，研究對象未包括HIV陽性及應用免疫抑制劑者。液相色譜數(shù)據(jù)通過軟件在蛋白數(shù)據(jù)庫中與相應蛋白及肽序列匹配，以確證鑒定菌種特異性Ag85B肽段，進而診斷Mtb及NTM感染。
　　結果:1、可鑒別Mtb及NTM的分枝桿菌Ag85B蛋白目標肽段的選擇
　　12種在UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫中被預測可能分泌Ag85B的分枝桿菌菌株的Ag85B氨基酸序列全長比對，提示了高同源性。與MtbAg85B蛋白

8、序列比較，常見感染的NTM如MAC及M.kansasiiAg85B蛋白展現(xiàn)了同Mtb較高的、超過80％的氨基酸序列同源性。Mtb Ag85B蛋白的理論胰酶酶切發(fā)現(xiàn)，肽NDPTQQIPK(m/z520.77，2+)顯示了可區(qū)分Mtb與NTM的潛力，并在Mtb Ag85B蛋白標準品的胰酶消化的多肽液中驗證了該目標肽段。
　　2、Ag85B菌種特異性氨基酸序列在Mtb及NTM菌株培養(yǎng)上清中的驗證及Ag85B抗原抗體復合物解離試驗方法學驗

9、證
　　包括Mtb及常見NTM的14種分枝桿菌菌株的培養(yǎng)上清，液相色譜DDA模式分析表明，肽m/z520.77及其Ag85B同源性序列在Mtb，MAC，M.kansasii及M.scrofulaceum的菌株分泌蛋白中被檢測到。在上述標準菌株培養(yǎng)上清中液相質(zhì)譜PRM模式掃描結果，進一步檢證了上述Ag85B菌種特異性目標肽段序列，且肽信號強度顯著增加。在體外模擬Mtb Ag85B抗原抗體復合物結合并摻入非結核病人血清，按照上述方法學

10、應用液相色譜可檢測到Ag85B菌種特異性目標片段。
　　3、在臨床病人痰或血清樣品中檢測Mtb或NTM
　　通過酶切后液相質(zhì)譜檢測的方法，在所有肺結核病人、肺MAC感染病人及肺M.kansasii感染的病人的痰結核菌培養(yǎng)液上清中檢測到了相應的菌種特異性Ag85B目標肽段，而在空白對照培養(yǎng)液中未檢測到Ag85B片段，敏感性及特異性均為100％。通過液相色譜檢測分枝桿菌Ag85B菌種特異性目標肽段，在34例MAC感染病人血清中檢

11、測的敏感性為88.2％，在21例M.kansasii感染病人血清中診斷的敏感性90.5％，在36例健康者的血清中未檢測到任何分枝桿菌Ag85B目標片段，特異性為100％。在87例肺結核病人血清中檢測的敏感性為93.1％，在38例結核性胸膜炎及41例肺外結核的病人中，診斷的敏感性分別為92.1％及92.7％，在48例潛伏性感染結核者中沒有檢測到Mtb目標Ag85B肽段，因此液相色譜檢測活躍性結核感染（合計166例）敏感性為92.7％，特異

12、性為100％。
　　結論:1、分枝桿菌Ag85B氨基酸序列的同源性較高，同Mtb相比，常見感染的NTM如MAC及M.kansasii Ag85B蛋白氨基酸序列同源性超過80％。蛋白序列比對提示肽NDPTQQIPK(m/z520.77，2+)及其同源性序列可做為液相質(zhì)譜目標片段鑒別Mtb與NTM。
　　2、在Mtb，MAC與M.kansasii的標準菌株培養(yǎng)上清中，可通過液相質(zhì)譜掃描驗證相應目標Ag85B菌種特異性肽段，從而鑒