單重PCR診斷手部非結(jié)核分枝桿菌感染初探.pdf

1、目的:通過特異性的單重PCR檢測手部非結(jié)核分枝桿菌，尋找快速、準確的診斷方法。
　　 方法:取臨床病例手部NTM感染的病灶組織20例，一份行病理檢測，一份提取病灶組織中非結(jié)核分枝桿菌DNA。選取感染手部常見的非結(jié)核分枝桿菌常見菌種，通過Genbank數(shù)據(jù)庫和文獻找到非結(jié)核分枝桿菌亞種的特異性基因片段5種，分別是hsp65、ITS2、IS1245、IS2404、P6123，根據(jù)靶序列設(shè)計引物。提取臨床標(biāo)本及標(biāo)準菌株的總DNA進行靶

2、序列的PCR，擴增條件如下:退火溫度55℃、退火溫度梯度52～63℃及63～70℃，引物濃度及循環(huán)次數(shù)分組，并計算檢測率，采取卡方檢驗，找到本實驗的最適宜條件。在最適宜PCR反應(yīng)體系下進行臨床標(biāo)本與標(biāo)準菌株DNA擴增，通過凝膠電泳的目的條帶比對，達到鑒定非結(jié)核分枝桿菌種及亞種，并進行靶序列測序。
　　 結(jié)果:1.臨床標(biāo)本組織單重PCR擴增出的目的條帶，與標(biāo)準菌株海分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌擴增出的目的條帶均符合。2.20例臨床標(biāo)本組

3、織檢測結(jié)果:海分枝桿菌11例，胞內(nèi)1例，鳥分枝桿菌1例，2例標(biāo)本出現(xiàn)雙重感染，1例是海分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌混合感染，1例是鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌混合感染，5例未檢測出。3.退火溫度63℃、反應(yīng)體積20ul、引物濃度2.5umol/L或5umol/L、循環(huán)30次或35次是本實驗最佳條件。4.DNA測序結(jié)果，標(biāo)準菌株海分枝桿菌及胞內(nèi)分枝桿菌與Genebank數(shù)據(jù)庫中海分枝桿菌與胞內(nèi)分枝桿菌的同緣性達99％，偶然分枝桿菌達100％，臨床標(biāo)