hsp65-、rpoB-PCR-RFLP用于非結核分枝桿菌菌種鑒定的研究.pdf

1、非結核分枝桿菌(NTM)是除結核分枝桿菌復合群(MTBC)、麻風分枝桿菌(M.leprae)外的一類分枝桿菌。NTM與MTBC均可引起肺部以及其它部位病變，而且臨床癥狀相似，鑒別診斷困難，所以分枝桿菌菌種鑒定對于疾病的診斷、治療及預后意義重大。以細菌培養(yǎng)為基礎的傳統(tǒng)生化鑒定方法，費力耗時，結果提供不及時，有時結果不準確。隨著分子生物學的發(fā)展，出現了眾多以分子生物學技術為基礎的鑒定方法，如PCR-SSCP、PCR-RFLP、DNA探針、D

2、NA芯片、DNA直接測序等，以其快速、高效、特異等優(yōu)點而受到青睞。本研究采用從國內收集的NTM分離株，探討基于hsp65和rpoB的PCR-RFLP對NTM分離株菌種鑒定的應用價值。
　　 1、hsp65-和rpoB-PCR-RFLP在非結核分枝桿菌臨床分離株鑒定應用中的效果評價
　　 用PNB/TCH試驗和多位點PCR從臨床分離株鑒定出NTM后，以hsp65測序作為金標準，用hsp65-和rpoB-PCR-RFLP將N

3、TM鑒定至種。結果，收集的130株省級結核病院鑒定為NTM的臨床分離株中，經我們進一步用PNB/TCH試驗和多位點PCR鑒定，22株為MTB，108株為NTM。PNB/TCH試驗與多位點PCR結果無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。多位點PCR所需時間較短。108株NTM中，經hsp65-和rpoB-PCR-RFLP鑒定為胞內分枝桿菌53株(49.07％)、膿腫分枝桿菌23株(21.30％)、鳥分枝桿菌19株(17.59％)、馬賽分枝桿菌和戈

4、登分枝桿菌各4株(3.70％)、首爾分枝桿菌、熊本分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、乳牛分枝桿菌和莫娜分枝桿菌各1株(0.93％)。福建NTM肺病病原種類繁多，以胞內分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和鳥分枝桿菌為主。以hsp65基因測序結果為標準，hsp65PCR-RFLP的敏感性為99.07％，特異性為100％，rpoBPCR-RFLP的敏感性為98.15％，特異性為100％。hsp65PCR-RFLP與rpoBPCR-RFLP結果差異無統(tǒng)計學意義(P＞

5、0.05)。
　　 2、動物標本分枝桿菌的分離與鑒定
　　 用中和離心法消化動物標本，分別接種L-J培養(yǎng)基和MGIT960培養(yǎng)基進行分枝桿菌分離培養(yǎng)。用PNB/TCH試驗、hsp65DNA直接測序、hsp65-和rpoB-PCR-RFLP、多位點PCR和Spoligotyping進行分離株菌種鑒定。從110份動物標本中共分離到29株抗酸桿菌，經鑒定，19株為NTM，包括偶發(fā)分枝桿菌11株(57.89％)、膿毒分枝桿菌5株