日本血吸蟲(chóng)主要蟲(chóng)卵抗原Sjp40的功能研究.pdf

1、本文以日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵主要抗原Sjp40(Major eggantigen of Schistosomajaponicum，Sjp40)作為研究靶標(biāo)分子，建立日本血吸蟲(chóng)感染新西蘭白兔和BALB/c小鼠模型，一方面利用RNA干擾技術(shù)初步研究該分子對(duì)剛完成雌雄合抱處于配子發(fā)生期的感染后第19天(19 days post-infection，19dpi)組雌雄蟲(chóng)合抱的影響及對(duì)完全性成熟處于產(chǎn)卵高峰期的45 dpi組雌蟲(chóng)產(chǎn)卵量的影響這兩方面的生物

2、學(xué)功能;另一方面取未成熟蟲(chóng)卵沉積但尚未發(fā)生肉芽腫病變的29 dpi新西蘭白兔肝臟組織以及大量成熟蟲(chóng)卵聚集并發(fā)生廣泛肉芽腫急性病變期的45 dpi肝臟組織進(jìn)行Sjp40的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量測(cè)定及免疫熒光定位，并進(jìn)行了初步的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，為解析Sjp40在日本血吸蟲(chóng)病肉芽腫病變的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　一、日本血吸蟲(chóng)雌雄蟲(chóng)Sjp40的siRNA干擾及其初步功能研究
　　目的：
　　研究日本血吸蟲(chóng)Sjp40基因

3、的體外RNA干擾效應(yīng);初步觀察Sjp40基因干擾后對(duì)處于配子發(fā)生期（19 dpi組）的雌雄蟲(chóng)合抱率及大量產(chǎn)卵期（45 dpi組）的雌蟲(chóng)產(chǎn)卵量的影響。
　　方法：
　　1.利用http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/網(wǎng)站設(shè)計(jì)、篩選3對(duì)針對(duì)Sjp40基因編碼區(qū)(CDS)的siRNA序列，陰性對(duì)照選用通用siRNA對(duì)照，所有siRNA標(biāo)記FAM熒光。
　　2.

4、日本血吸蟲(chóng)尾蚴（湖南株）自野生型陽(yáng)性釘螺逸出，采用貼片法經(jīng)腹部感染新西蘭白兔，于感染后第19d(19 dpi)、29 d(29 dpi)、34 d(34 dpi)和45 d(45 dpi)剖殺，經(jīng)門靜脈灌注收集成蟲(chóng)。
　　3.成蟲(chóng)經(jīng)PBS(pH7.4)沖洗3次后轉(zhuǎn)入RPMI1640完全培養(yǎng)基，置5％ CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
　　4.收集19 dpi、29 dpi、34 dpi和45 dpi以及培養(yǎng)各天數(shù)的雌雄蟲(chóng)，備提取總

5、RNA。
　　5.浸泡法轉(zhuǎn)染終濃度為200 nmol/L的siRNA40至19 dpi組雌雄合抱日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)，同步設(shè)立陰性對(duì)照和空白對(duì)照。5％ CO2，37℃，干擾3d、5d后，雌雄蟲(chóng)分開(kāi)收集，PBS洗滌3次，備提取RNA。同步觀察并統(tǒng)計(jì)RNA干擾5d后雌雄蟲(chóng)合抱情況。
　　6.電穿孔法轉(zhuǎn)染終濃度為200 nmol/L的siRNA40至45 dpi日本血吸蟲(chóng)雌雄合抱成蟲(chóng)，同步設(shè)立陰性對(duì)照和空白對(duì)照。RNA干擾48 h后雌雄

6、蟲(chóng)體分開(kāi)收集，經(jīng)PBS(pH7.4)洗滌3次，備提取總RNA。同步在顯微鏡下觀察并比較各組產(chǎn)卵量。
　　7.按Trizol試劑說(shuō)明書提取日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)/雄蟲(chóng)總RNA，經(jīng)DNaseⅠ消化，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR檢測(cè)Sjp40基因mRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.日本血吸蟲(chóng)雌雄合抱后的發(fā)育進(jìn)程中，雄蟲(chóng)Sjp40基因的轉(zhuǎn)錄水平在本研究檢測(cè)各點(diǎn)中呈穩(wěn)定性低表達(dá);雌蟲(chóng)Sjp40基因的轉(zhuǎn)錄水平在本研究檢測(cè)各點(diǎn)中波

7、動(dòng)較大，主要表現(xiàn)在19 dpi雌雄合抱成蟲(chóng)體外培養(yǎng)第2d和第3d時(shí)，雌蟲(chóng)Sjp40基因的轉(zhuǎn)錄水平處于和雄蟲(chóng)同樣的較低水平，而在培養(yǎng)的第5d和第9dSjp40基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，29 dpi組、34 dpi組和45 dpi組雌蟲(chóng)Sjp40基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于雄蟲(chóng)，且在此較高水平上有一定波動(dòng)。
　　2.浸泡法遞送siRNA干擾19 dpi組雌雄合抱成蟲(chóng)中Sjp40 mRNA表達(dá)，干擾效應(yīng)呈現(xiàn)性別差異:以陰性對(duì)照組為基線，雌蟲(chóng)S

8、jp40 mRNA水平在RNA干擾后的第3d無(wú)顯著下降，第5d下降～60％;而雄蟲(chóng)Sjp40 mRNA水平在RNA干擾后的第3d和第5d均未出現(xiàn)顯著下降。siRNA40干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間的雌雄合抱率在干擾后第5d無(wú)顯著性差異。
　　3.電穿孔法遞送siRNA干擾45 dpi雌雄合抱成蟲(chóng)中Sjp40 mRNA表達(dá)，干擾效應(yīng)亦呈現(xiàn)性別差異:以陰性對(duì)照組為基線，雌蟲(chóng)Sjp40 mRNA水平在RNA干擾48 h后下降～55％

9、;而雄蟲(chóng)Sjp40 mRNA水平變化在RNA干擾前后無(wú)顯著性差異。顯微鏡下初步觀察到:RNA干擾48 h后，與陰性對(duì)照組相比，siRNA40實(shí)驗(yàn)組的雌蟲(chóng)產(chǎn)卵量明顯減少。
　　4.日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)/雄蟲(chóng)各20條的Sjp40基因克隆測(cè)序結(jié)果顯示:Sjp40基因CDS區(qū)高度保守，一致性為100％。
　　5.參照模式生物秀麗隱桿線蟲(chóng)，日本血吸蟲(chóng)所具有的RNAi效應(yīng)器成分（小RNA生物合成，dsRNA攝入、擴(kuò)散，放大效應(yīng)蛋白，Argon

10、autes和RISC，RNAi抑制蛋白，核RNAi效應(yīng)器）種類齊全，但每類RNAi效應(yīng)器的數(shù)量減少。
　　結(jié)論：
　　1.日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)Sjp40轉(zhuǎn)錄水平在19 dpi雌雄合抱成蟲(chóng)體外培養(yǎng)第5d開(kāi)始迅速增加，其后各檢測(cè)點(diǎn)中一直處于高表達(dá)，且顯著高于雄蟲(chóng)Sjp40轉(zhuǎn)錄水平。在siRNA40成功降低45 dpi組雌蟲(chóng)Sjp40表達(dá)后，初步觀察到雌蟲(chóng)產(chǎn)卵量明顯減少，提示雌蟲(chóng)Sjp40基因與雌蟲(chóng)產(chǎn)卵密切相關(guān)。
　　2.siRN

11、A40干擾配子發(fā)生期（19 dpi組）雌蟲(chóng)Sjp40基因后，初步發(fā)現(xiàn)雌蟲(chóng)Sjp40與雌雄合抱無(wú)明顯相關(guān)性。
　　3.RNA干擾19 dpi組和45 dpi組雌雄合抱成蟲(chóng)，雌、雄蟲(chóng)的Sjp40 RNA干擾效應(yīng)均存在明顯的性別差異。
　　4.Sjp40 RNA干擾效應(yīng)性別差異的發(fā)生與Sjp40基因水平性別多態(tài)性無(wú)關(guān)。二日本血吸蟲(chóng)感染動(dòng)物模型肝臟肉芽腫病變進(jìn)程Sjp40表達(dá)與免疫
　　二、定位及其初步組學(xué)分析
　　目的

12、：
　　觀察Sjp40在感染新西蘭白兔肝臟沉積蟲(chóng)卵及其肉芽腫病變形成中的表達(dá)情況及其免疫定位;對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染動(dòng)物模型肉芽腫病變進(jìn)程中的肝臟組織進(jìn)行初步組學(xué)分析。
　　方法：
　　1.日本血吸蟲(chóng)尾蚴（湖南株）自野生陽(yáng)性釘螺逸出，采用貼片法經(jīng)腹部感染新西蘭白兔和BALB/c小鼠，于感染后第29 d和45 d剖殺，收集未感染組、29dpi組和45 dpi組肝臟，未感染肝臟作為空白對(duì)照。
　　2.液氮快速研磨上述各期新

13、西蘭白兔和BALB/c小鼠肝臟成粉末狀后，分別加入Trizol，按TRIzol法提取各期肝臟總RNA，經(jīng)DNaseⅠ消化，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-qPCR檢測(cè)各期兔肝臟中Sjp40基因mRNA的表達(dá)。各期BALB/c小鼠肝臟RNA送公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;
　　3.同步提取各期新西蘭白兔肝臟可溶性總蛋白(total soluble protein，TSP)。以硫酸銨鹽析法和Protein G免疫親和柱層析法純化抗Sjp40-McAb9

14、G7（檢測(cè)抗體）和抗弓形蟲(chóng)tSAG1-McAb Y3A8（陰性對(duì)照抗體），Western-blot檢測(cè)Sjp40蛋白的表達(dá)。
　　4.制備各期新西蘭白兔肝臟石蠟切片，HE染色觀察肝臟中蟲(chóng)卵肉芽腫的形成與發(fā)展，進(jìn)一步以間接免疫熒光技術(shù)進(jìn)行Sjp40在肝臟沉積蟲(chóng)卵及肉芽腫組織中的定位。
　　結(jié)果：
　　1.日本血吸蟲(chóng)感染兔呈急性肝肉芽腫病變期的45 dpi肝臟沉積蟲(chóng)卵中Sjp40mRNA水平顯著高于29 dpi尚未形成蟲(chóng)卵

15、肉芽腫結(jié)節(jié)的肝臟沉積的未成熟蟲(chóng)卵(P＜0.05)。
　　2.抗Sjp40-McAb9G7特異性檢測(cè)到Sjp40蛋白在29 dpi和45 dpi新西蘭白兔肝臟中的表達(dá)。
　　3.HE染色片觀察顯示29 dpi新西蘭白兔肝臟中蟲(chóng)卵極少，且皆為未成熟蟲(chóng)卵，尚未見(jiàn)蟲(chóng)卵肉芽腫形成，但肝臟已有輕微病變;45 dpi新西蘭白兔肝臟中則顯示有成熟蟲(chóng)卵大量成簇沉著，蟲(chóng)卵肉芽腫廣泛分布。
　　4.間接免疫熒光結(jié)果顯示:Sjp40在29 d

16、pi新西蘭白兔肝臟中定位于未成熟蟲(chóng)卵內(nèi)，而45 dpi，可見(jiàn)感染新西蘭白兔肝臟中沉積的大量成簇內(nèi)含毛蚴的成熟蟲(chóng)卵及其周圍肉芽腫組織均有明顯熒光。
　　5.轉(zhuǎn)錄組學(xué)初步結(jié)果顯示:29 dpi BALB/c小鼠肝臟比對(duì)到小鼠基因組((http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html＃mouse))和日本血吸蟲(chóng)基因組((http://lifecenter.sgst.cn/schistosoma/

17、cn/schdownload.do))的mapped reads分別為105，021，590(91.47％)和43，117(1.5％)條。測(cè)序共獲得日本血吸蟲(chóng)已知轉(zhuǎn)錄本為4238個(gè)，新轉(zhuǎn)錄本為221個(gè)。其中測(cè)序深度大于10且表達(dá)量大于500的日本血吸蟲(chóng)已知轉(zhuǎn)錄本為10個(gè)，其中Sjp40表達(dá)量居首位。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用IBM SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，29 dpi組和45 dpi組兩組兔肝臟沉積蟲(chóng)卵間Sjp40的mRNA

18、表達(dá)差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.Sjp40在日本血吸蟲(chóng)感染兔肝臟中的表達(dá)量隨蟲(chóng)卵發(fā)育成熟而顯著增加，并由蟲(chóng)卵擴(kuò)散至其周圍肉芽腫組織，提示該分子在血吸蟲(chóng)肉芽腫的形成與發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。
　　2.29 dpi BALB/c小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)初步分析結(jié)果顯示，Sjp40在測(cè)序深度大于10且表達(dá)量大于500的轉(zhuǎn)錄本中呈最高量表達(dá)，進(jìn)一步提示Sjp40應(yīng)在29 dpiBA