日本血吸蟲卵對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、克隆病(Crohn’s disease)是一種發(fā)生于腸道的自身免疫性疾病。近五十年來，其發(fā)病率在發(fā)達(dá)國家呈上升趨勢，而在衛(wèi)生條件不足、欠發(fā)達(dá)的第三世界國家則較低，由此有學(xué)者提出“衛(wèi)生假說(hygiene hypothesis)”，即兒童早期對(duì)一些病原體如某些蠕蟲、病毒或細(xì)菌等的接觸有助于自身耐受的形成和維持免疫平衡，從而減少過敏性和自身免疫性疾病的發(fā)生。此機(jī)制可能與蠕蟲感染可以調(diào)節(jié)Th1或Th2免疫反應(yīng)有關(guān)。
　　 蠕蟲的慢性感

2、染可以引起以IL-4升高為主的Th2類反應(yīng)的發(fā)生，而IL-4可抑制Th1類細(xì)胞的分化，因此IL-4可以對(duì)宿主的免疫進(jìn)行調(diào)節(jié)，并且在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用，它可以抑制Th1類反應(yīng)相關(guān)的自身免疫性疾病。2,4,6 三硝基苯磺酸(trinitrobenzesulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎具有與克隆病類似的發(fā)病特點(diǎn),是以Th1型介導(dǎo)為主的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生高水平的前炎癥因子IFN-γ，從而在結(jié)腸引發(fā)嚴(yán)重的炎癥。血吸

3、蟲感染后幼蟲和成蟲引起Th1為主的免疫反應(yīng)，產(chǎn)卵后蟲卵誘發(fā)以Th2為主的免疫反應(yīng)。而調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)，這群具有免疫抑制作用的細(xì)胞亞群可以識(shí)別自身抗原肽，分泌抑制性細(xì)胞因子如IL-10，從而抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞和輔助T細(xì)胞的活化，抑制過度的Th1/Th2極化，防止自身免疫的發(fā)生并控制各種形式的免疫反應(yīng)。在血吸蟲的感染中，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞也參與其免疫調(diào)節(jié)，但有關(guān)血吸蟲誘導(dǎo)產(chǎn)生的Tregs在

4、CD中的作用目前還未見報(bào)道。
　　 本文探討了日本血吸蟲卵對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的影響及調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞在日本血吸蟲卵對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的免疫調(diào)節(jié)中的作用。本論文包括日本血吸蟲卵對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎保護(hù)作用的觀察和日本血吸蟲卵對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎保護(hù)作用機(jī)制的研究兩部分：
　　 一、日本血吸蟲卵對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎保護(hù)作用的觀察
　　 目的：觀察日本血吸蟲卵對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的保護(hù)作

5、用。方法：50只6～8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分組，10只/組，分別為正常對(duì)照組、乙醇對(duì)照組、血吸蟲卵免疫對(duì)照組、TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎組和蟲卵免疫后TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎組。蟲卵懸于100 μl pH 7.4 PBS，以10 000個(gè)蟲卵/鼠，分別于第0、7、14和21天經(jīng)腹腔注射免疫小鼠，正常對(duì)照組小鼠僅給予相同劑量PBS。末次免疫后第5天，小鼠乙醚輕度麻醉后，用直徑2 mm的灌腸器從肛門插入結(jié)腸約4 cm處,實(shí)驗(yàn)組小鼠注入2[％

6、] TNBS (50[％]乙醇配制)0.1ml，正常對(duì)照組和乙醇對(duì)照組分別注入等體積的生理鹽水、50[％] 乙醇,使灌注液能夠到達(dá)盲腸，并保持小鼠垂直狀態(tài)約30 s。誘導(dǎo)結(jié)腸炎后第6天，剖殺小鼠，剪取肛門至盲腸腸管，沿腸系膜縱軸剪開，用冰生理鹽水沖洗后，常規(guī)10[％]甲醛固定24 h，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色后，顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察，并對(duì)炎癥進(jìn)行分級(jí)。同時(shí)無菌取脾,制備淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至3×106/ ml。將小鼠脾淋巴細(xì)

7、胞懸液加至24 孔培養(yǎng)板中,1 ml/ 孔,每孔分別加Con A 5 μg/ml，雙抗(青霉素和鏈霉素)100 U/ml，置37 ℃，5[％] CO2 培養(yǎng)箱，72 h后離心取上清液,用ELISA 雙抗體夾心法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ和IL-4 水平。觀察各組小鼠體重、糞便情況、結(jié)腸病理改變及細(xì)胞因子水平的變化。結(jié)果：生理鹽水、50％乙醇處理和單純蟲卵免疫組小鼠未見稀便、粘液便或血便，其體重隨著時(shí)間的延長呈逐漸增長趨勢；

8、未給予蟲卵免疫的TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎組小鼠在誘導(dǎo)后第1天即出現(xiàn)不同程度的稀便或粘液血便；給予蟲卵的結(jié)腸炎小鼠則多為稀便，粘液血便少見，但兩者在TNBS誘導(dǎo)后體重均明顯下降，與其它組比較有顯著性差異 (P<0.01)。給予蟲卵免疫的結(jié)腸炎小鼠體重從第3天開始逐漸恢復(fù)，至第5天接近未誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠水平。TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎后第6天，剖殺各實(shí)驗(yàn)組小鼠，50[％]乙醇灌腸小鼠結(jié)腸未見充血水腫；TNBS模型組小鼠結(jié)腸明顯充血水腫，有散在小潰瘍形成；蟲

9、卵免疫結(jié)腸炎組小鼠則無充血水腫，結(jié)腸表面光滑。鏡下，TNBS模型組小鼠腸壁明顯增厚，組織上皮破損，炎性滲出,大量白細(xì)胞浸潤并伴明顯組織壞死，腺體結(jié)構(gòu)部分消失；蟲卵免疫的結(jié)腸炎小鼠則炎癥較輕，黏膜結(jié)構(gòu)完整。給予蟲卵和未給予蟲卵的結(jié)腸炎小鼠組織學(xué)分級(jí)分別為3.6±0.49和1.6±0.70 (P<0.0005)。小鼠經(jīng)TNBS誘導(dǎo)后，Th1類細(xì)胞因子IFN-γ水平為3.47±0.87 ng/ml，Th2類細(xì)胞因子IL-4水平為146.06±

10、45.76 pg/ml。預(yù)先經(jīng)蟲卵免疫的結(jié)腸炎小鼠則炎癥得到明顯控制，癥狀較輕，體重恢復(fù)較快，且IL-4水平顯著升高至598.50±135.90 pg/ml而IFN-γ表達(dá)被明顯抑制其水平為1.53±0.51 ng/ml。結(jié)論：本研究首次證實(shí)日本血吸蟲卵對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有保護(hù)作用。
　　 二、日本血吸蟲卵對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎保護(hù)作用機(jī)制的研究
　　 目的：探討日本血吸蟲卵對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎保護(hù)作用的免疫

11、調(diào)節(jié)機(jī)制。方法：40只6～8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分組，10只/組,分為PBS對(duì)照組、血吸蟲卵免疫對(duì)照組、TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎組和蟲卵免疫后TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎組。將蟲卵懸于100 μl pH 7.4 PBS中，以10 000個(gè)蟲卵/鼠分別于第0、7、14和21 d經(jīng)腹腔注射免疫小鼠，對(duì)照組小鼠給予等體積PBS。末次免疫后第5 d，小鼠禁食24 h，自由飲水。乙醚輕度麻醉后，用直徑2 mm的灌腸器從肛門插入結(jié)腸約4 cm處,實(shí)驗(yàn)

12、組小鼠注入2[％] TNBS 0.1 ml，對(duì)照組注入等體積的生理鹽水,使灌注液能夠到達(dá)盲腸，并保持小鼠垂直狀態(tài)約30 s。誘導(dǎo)結(jié)腸炎后第6 d剖殺小鼠，無菌取脾,制備淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至3×106/ ml。將小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液加至24 孔培養(yǎng)板中,1 ml/ 孔,每孔分別加Con A 5 μg/ml，雙抗(青霉素和鏈霉素)100 U/ml，置37 ℃，5[％] CO2 培養(yǎng)箱，72 h后離心取上清液，用ELISA 雙抗體夾心法檢

13、測小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-10水平。取上述各組1×106脾細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞亞群水平。結(jié)果：未經(jīng)蟲卵免疫的小鼠經(jīng)TNBS誘導(dǎo)后結(jié)腸炎癥狀明顯，細(xì)胞因子IFN-γ水平高達(dá)3.47±0.87 ng/ml，IL-4、IL-5和IL-10水平則較低分別為146.06±45.76 pg/ml，140.32±39.01 pg/ml，385.91±134.89 pg

14、/ml；經(jīng)蟲卵免疫的結(jié)腸炎小鼠的炎癥得到明顯控制，IFN-γ表達(dá)被明顯抑制其水平為1.53±0.51 ng/ml，IL-4、IL-5和IL-10水平顯著升高分別為598.50±135.90 pg/ml，217.86±77.82 pg/ml，799.651±197.93 pg/ml。經(jīng)蟲卵免疫的結(jié)腸炎小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞亞群比例為3.55±0.81[％]顯著高于未免疫組結(jié)腸炎小鼠的2.31±0.39[％]。結(jié)論：1

15、.首次確定了日本血吸蟲卵對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠有保護(hù)作用，在TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎之前給予日本血吸蟲卵，可以升高Th2類細(xì)胞因子IL-4、IL-5以及 IL-10的水平，抑制過度的Th1反應(yīng)及引起的炎癥反應(yīng)；2.首次證實(shí)日本血吸蟲卵對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的保護(hù)作用與CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞有關(guān)；3.提示誘生抗原特異性調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞可能成為治療自身免疫性疾病的一條新途徑，為變害為利，進(jìn)一步開發(fā)利用寄生蟲資源奠定了基礎(chǔ)。