日本血吸蟲感染小鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)蟲卵死活鑒別及抗原檢測的研究.pdf

1、第一章Sj蟲卵內(nèi)抗氧化酶檢測及用于鑒別蟲卵死活的研究
　　 [目的]檢測日本血吸蟲（Sj）不同發(fā)育程度蟲卵內(nèi)抗氧化酶水平，分析其是否可作為判別宿主體內(nèi)血吸蟲卵死與活的標志物。
　　 [方法]采用3，3-二甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(DAB)+H2O2的底物系統(tǒng)作為抗氧化酶檢測方法對完整Sj蟲卵進行染色觀察，并探索其染色條件。建立Sj感染后第50d和90d有活蟲體寄生的小鼠模型與其治后30d和90d無活蟲的小鼠模型。用抗氧化酶染色最

2、佳條件對各模型組小鼠肝腸組織分離出的游離蟲卵作生化檢測，比較觀察其對未成熟卵、成熟卵、近期變性卵和遠期變性卵的染色結(jié)果，并依據(jù)其顯色程度與其分布情況評價抗氧化酶水平，分析其用于判別Sj蟲卵死與活的可能性。用超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX、)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒測定分析蟲卵內(nèi)抗氧化酶類型及其水平。
　　 [結(jié)果]與未做染色的蟲卵比，DAB底物系統(tǒng)加入完整游離活卵中經(jīng)

3、室溫震動反應(yīng)30min時，所呈現(xiàn)的深棕黃色的陽性反差最明顯;DAB底物系統(tǒng)加入經(jīng)100℃水浴處理30min完整游離活卵作檢測時，未見呈顯色反應(yīng);用DAB底物系統(tǒng)對Sj感染50d、90d及治后30d和90d的模型鼠肝腸來源蟲卵染色的陽性率分別為92.34％、46.03％、13.68％和0.00％。陽性反應(yīng)程度分析顯示:未成熟蟲卵普遍呈深棕黃色;成熟卵多呈深黃色，分布于毛蚴體部;近期變性卵中部分有顯色反應(yīng)，且多為未成熟卵;遠期變性卵和卵殼均

4、無顯色反應(yīng)。SOD、GSH-PX、POD和CAT校正濃度的各自構(gòu)成比在未成熟中分別為64.1％、28.4％、3.6％和3.9％，在成熟蟲卵中分別為72.7％、21.8％、2.0％和3.6％。
　　 [結(jié)論]證明Sj活蟲卵內(nèi)均富含抗氧化酶成分，且以SOD和GSH-PX抗氧化酶類為主。在未成熟卵中含量高，且隨著蟲卵發(fā)育成熟至死亡而逐漸減低，并可作為鑒別游離Sj完整蟲卵死與活的標志物。
　　 第二章Sj感染鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)蟲卵游離

5、的方法探索
　　 [目的]探索游離組織內(nèi)蟲卵的方法，改善活檢組織內(nèi)蟲卵做抗氧化酶染色鑒別其死活的效果。
　　 [方法]采用壓片、剪切、超聲、化學(xué)(5％NaOH)消化、酶（0.5％胰蛋白酶和1％胃蛋白酶）消化共6種方法對小鼠腸黏膜模擬活檢組織進行處理，觀察蟲卵游離出組織及用DAB染色的效果。
　　 [結(jié)果]在6種處理方法中，可使蟲卵較好地游離出組織和獲得較理想抗氧化酶染色效果的是胰蛋白酶消化法。壓片和剪切法對蟲卵游

6、離效果差。超聲法可使部分蟲卵破裂和丟失。NaOH和胃蛋白酶二者消化法主要影響抗氧化酶染色效果。
　　 [結(jié)論]胰蛋白酶消化法可使腸黏膜內(nèi)大部分蟲卵游離，并獲得良好的抗氧化酶染色效果，但仍需進一步解決全部蟲卵游離出組織的問題。
　　 第三章Sj感染鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)蟲卵分泌抗原檢測的研究
　　 [目的]檢測感染鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)血吸蟲卵內(nèi)的毛蚴分泌滲出到宿主組織的可溶性抗原，為研發(fā)一種可彌補活檢腸黏膜查見蟲卵不足的診斷方法提供

7、實驗依據(jù)。
　　 [方法]制備兔抗和鼠抗血吸蟲卵多克隆抗體，探索酶免疫組化和熒光免疫組化檢測感染鼠腸黏膜內(nèi)血吸蟲卵抗原的可行性，建立間接夾心ELISA法，探索好最佳條件后，對正常鼠、感染后90d鼠、治后1M鼠和治后3M鼠的結(jié)腸黏膜，取模擬活檢組織塊大小，經(jīng)鏡下分出有蟲卵和無蟲卵的組織后，又分超聲和勻漿兩法處理的上清液分別進行比較檢測。依據(jù)OD值≥陰性參考對照的2.1倍被確定為陽性;用間接酶免疫組化法對各組小鼠結(jié)腸石蠟切片標本比較

8、檢測，觀察到黏膜組織中出現(xiàn)棕黃色被判為陽性。依據(jù)兩法檢出的陽性率做出統(tǒng)計分析及效果評價。
　　 [結(jié)果]酶免疫組化法未獲得陽性結(jié)果;熒光免疫組化法檢測到組織中蟲卵抗原，但效果不理想;用間接夾心ELISA法檢測結(jié)果顯示:對經(jīng)超聲處理的含蟲卵黏膜和不含蟲卵黏膜內(nèi)的抗原陽性檢出率在A組（感染90d小鼠組）分別為58.97％和60.00％，在B組（感染50d后治療1M小鼠組）分別為37.50％和25.00％，在C組（感染50d后治療3M