日本血吸蟲組織蛋白酶B2在小鼠抗血吸蟲再感染中的作用研究.pdf

1、目的:構(gòu)建日本血吸蟲組織蛋白酶 B(Sjcb2)真核和原核表達(dá)載體,檢測(cè)日本血吸蟲組織蛋白酶B2單獨(dú)或者聯(lián)合吡喹酮(PZQ)在小鼠抗血吸蟲再感染中的作用,為血吸蟲病防治開辟新的途徑以及探索新的方法。
　　方法:用PRIMER5.0引物設(shè)計(jì)軟件自行設(shè)計(jì)引物,采用PCR法擴(kuò)增Sjcb2基因片段,PCR產(chǎn)物純化后,與pMD19-T載體連接,經(jīng)藍(lán)白斑篩選、雙酶切以及PCR鑒定后,經(jīng)測(cè)序鑒定與原序列一致,亞克隆入pcDNA3.1(+)真核表

2、達(dá)載體和PET43原核表達(dá)載體中,經(jīng)抗生素(氨芐青霉素)篩選、雙酶切鑒定、PCR鑒定及測(cè)序鑒定后,并大量制備pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒,將pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒注射到BALB/c小鼠后腿股四頭肌肌肉組織中,每周免疫一次,共免疫3次。末次免疫后,用日本血吸蟲尾蚴感染BALB/c小鼠,六周后使用吡喹酮(PZQ)進(jìn)行化療;共分為6個(gè)組,所有組在8周攻擊感染后,再過6周后處死全部小鼠。光鏡下選單個(gè)蟲卵肉芽腫測(cè)

3、量最大直徑,檢測(cè)機(jī)體對(duì)血吸蟲病理反應(yīng);采用間接ELISA檢測(cè)特異性IgE和IgG亞型(IgG1, IgG2和IgG3)。采用門靜脈灌注法,檢測(cè)小鼠所荷成蟲數(shù)。按照R％=100-〔(n1-n2)/N×100〕公式,計(jì)算抗血吸蟲再感染率。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建 pET43/Sjcb2原核表達(dá)載體,經(jīng)測(cè)序鑒定與原序列一致,并在 E.coli DH5α中表達(dá)出一分子量約為90 kDa的重組融合蛋白, Western-blotting檢測(cè),可

4、出現(xiàn)特異性條帶。成功構(gòu)建pcDNA3.1(+)/Sjcb2真核表達(dá)載體,經(jīng)測(cè)序鑒定與原序列一致,并大量制備pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒。將核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Sjcb2單獨(dú)免疫BALB/c小鼠,或者聯(lián)合吡喹酮進(jìn)行處理,通過檢測(cè)小鼠荷蟲數(shù)和計(jì)算抗血吸蟲再感染率,結(jié)果顯示 PZQ處理組、Sjcb2(pcDNA3.1(+)/Sjcb2)免疫組、聯(lián)合組與感染攻擊組比較,血吸蟲尾蚴初次感染后的小鼠荷蟲數(shù)均有顯著差異(P<

5、0.01)。而 Sjcb2免疫組與攻擊對(duì)照組比較, Sjcb2免疫組小鼠荷蟲數(shù)也有顯著性差異(P<0.01)。PZQ處理組與感染攻擊組相比,抗血吸蟲再感染率明顯下降,并且有顯著性差異(P<0.01)。Sjcb2免疫組、聯(lián)合組與感染攻擊組、空質(zhì)粒處理組以及 PZQ處理組比較,抗血吸蟲再感染率有顯著性差異(P<0.01),其中Sjcb2免疫組抗血吸蟲再感染率(87.0%)最高。通過測(cè)量蟲卵肉芽腫直徑,結(jié)果顯示Sjcb2免疫組、PZQ組和聯(lián)合

6、組與感染攻擊組相比,蟲卵肉芽腫直徑都明顯的減小(P<0.01),其中聯(lián)合處理組蟲卵肉芽腫直徑減小最明顯。通過采用ELISA檢測(cè)血清抗抗體水平,結(jié)果顯示Sjcb2免疫組和聯(lián)合處理組與感染攻擊組和PZQ處理組比較,抗 IgG1水平明顯下降,IgG2水平升高,有顯著性差異(P<0.01);而IgG3水平,聯(lián)合處理組和Sjcb2免疫組與感染攻擊組比較,甚至和其他組相比,沒有顯著性差異(P>0.05)。聯(lián)合處理組和Sjcb2免疫組組的IgE水平,

7、與PZQ處理組比較,明顯的升高,有顯著性差異(P<0.01);Sjcb2免疫組IgE水平,與感染攻擊組比較,也明顯升高,有顯著性差異(P<0.01)。
　　結(jié)論:1. Sjcb2應(yīng)用在日本血吸蟲小鼠模型中具有抗日本血吸蟲再感染作用,其抗再感染作用機(jī)制可能與特異性IgE的升高和IgG1的降低有關(guān)。
　　2. Sjcb2免疫聯(lián)合吡喹酮應(yīng)用在日本血吸蟲再感染小鼠模型中,可以減小蟲卵肉芽腫直徑,可能是Sjcb2和吡喹酮共同作用減輕了