IFN-誘導的p47 GTP酶在日本血吸蟲急性感染中的作用研究.pdf

1、目前，血吸蟲病防治面臨的棘手問題之一在于再感染難以控制，人們一直期待采用人用疫苗作為化療重要的補充手段進行疾病控制，因此，血吸蟲感染宿主的免疫應答規(guī)律作為疫苗研制的免疫學基礎受到更多關注。然而長期以來，疫苗研制的理論基礎一直成為眾多學者有爭議的焦點。傳統(tǒng)意義上的以激發(fā)Th2型免疫應答(以IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細胞因子分泌為主，主要介導體液免疫)的血吸蟲病疫苗，主要采用特異性抗體篩選優(yōu)勢抗原，所誘導的保護力往往并不理想

2、。目前更多的證據(jù)支持Th1型免疫應答(以IFN-γ分泌為主，主要介導細胞免疫)作為抗血吸蟲感染的保護性效應機制。 曼氏血吸蟲感染小鼠模型中細胞因子的動態(tài)變化結果顯示，在童蟲移行并發(fā)育成熟過程中，淋巴細胞主要產生針對童蟲或成蟲抗原的IFN-γ；隨著組織中蟲卵的沉積(感染后5w)，細胞因子表達譜逐漸發(fā)生了改變，到感染后8w，主要以高水平的IL-4、IL-5為主，IFN-γ水平較低，提示在感染早期，IFN-γ,可能發(fā)揮重要的作用；在蟲

3、卵沉積后，宿主的免疫應答出現(xiàn)由Th1型向Th2型的漂移。本實驗室前期采用基因芯片結合流式細胞術等技術研究日本血吸蟲感染小鼠過程中觀察到：如同曼氏血吸蟲感染，IFN-γ的基因轉錄水平從感染急性期至慢性期逐步受到抑制；但是值得關注的是，干擾素刺激基因(ISGs)(如：IGTP，GBP，ICSBP等)，受抑制程度尤為顯著，表現(xiàn)為下調發(fā)生較IFN-γ早(成蟲排卵前)，且下調速度更快。ISGs是IFN-γ下游通路中的作用因子，其表達下調則反映出隨

4、著日本血吸蟲感染進程，宿主體內存在著干擾素通路的抑制，阻礙干擾素生物學效應的發(fā)揮。 IFN-誘導的p47 GTP酶家族是近十年來在多種脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的一類重要的具有抗感染作用的蛋白家族。目前已經克隆了小鼠p47GTP酶家族中的六個成員，分別是LRG-47、GTPI、IGTP、IRG-47、IIGP和TGTP/Mg21。研究發(fā)現(xiàn)，p47 GTP酶能夠特異地參與抵抗胞內細菌和原蟲的感染，對病毒的清除能力較弱。雖然同屬于p47 GTP

5、酶家族，但不同成員所表達的抗力具有病原體和時相特異性的特點。然而，p47 GTP酶在更為復雜的多細胞生物，例如重要的胞外蠕蟲-血吸蟲感染中的作用目前還未見報道。鑒于本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，p47GTP酶隨日本血吸蟲感染進程，信號強度呈下調趨勢，且家族中各成員的表達強度存在明顯差異，提示不同p47 GTP酶在多細胞生物感染中的作用可能不盡相同。在本研究中，我們探討了IFN-誘導的p47 GTP酶家族中的IGTP和IRG-47在日本血吸蟲急性

6、感染中的作用特點及參與保護性免疫的能力，以進一步深化血吸蟲的感染免疫學，為血吸蟲病疫苗研制提供理論基礎。 本研究采用IGTP基因敲除(IGTP-/-)和IRG-47基因敲除(IRG-47-/-)小鼠，以相同遺傳背景的野生型C57BL/6J小鼠(wild-type，WT)為對照，建立日本血吸蟲急性感染的小鼠模型。為了觀察感染/致病結果，在感染后6w通過肝門靜脈沖蟲計數(shù)成蟲數(shù)、消化肝臟計數(shù)蟲卵數(shù)，以HE染色和Masson三色染色觀察

7、肝臟的病理變化；為了觀察感染后宿主的整體免疫應答反應，以間接ELISA法檢測血清中日本血吸蟲特異性IgG抗體，以Bio-plex技術檢測感染急性期血清和脾臟淋巴細胞培養(yǎng)上清中Thl/Th2型細胞因子的表達水平；鑒于p47 GTP酶主要表達在巨噬細胞以及巨噬細胞在天然免疫中的重要作用，我們觀察了基因敲除后對巨噬細胞功能的影響。通過貼壁法分離純化脾臟巨噬細胞后，采用熒光實時定量PCR法檢測巨噬細胞中p47 GTP酶家族三個成員(igtp、ι

8、rg47、irg47)的mRNA水平，以考察一種基因缺失后是否存在p47 GTP酶家族其他成員的交叉調控；以流式細胞術檢測不同時期(感染前、蟲卵沉積前期、感染急性期)巨噬細胞上表面分子MHC-Ⅱ類、CDl6/32、CD40、CD80的表達水平，觀察巨噬細胞的抗原遞呈功能；在脂多糖(LPS)刺激下，采用硝酸還原酶法觀察巨噬細胞培養(yǎng)上清中一氧化氮(NO)的濃度；通過體外殺傷童蟲的試驗，觀察在血清抗體的協(xié)同下巨噬細胞的殺傷活性。 本研

9、究獲得如下主要結果： 1、在日本血吸蟲急性感染過程中，IGTP4-/-小鼠與WT小鼠相比表現(xiàn)出相似的感染結局，而IRG-47-/-小鼠能部分限制急性感染。IGTP-/-組的成蟲數(shù)和蟲卵數(shù)略高于WT組，而與這兩組相比，感染后IRG-47-/-組小鼠的成蟲數(shù)和蟲卵數(shù)明顯減少。在HE染色的病理切片中，IGTP-/-組和WT組可見大量蟲卵聚集在匯管區(qū)，而IRG-47-/-組集中在匯管區(qū)的蟲卵則較少。在IRG-474-/-組，含有單個蟲卵

10、的肉芽腫中可見大量的嗜酸性粒細胞聚集，包繞蟲卵的細胞總數(shù)也較IGTP-/-組和WT組顯著增多。Masson染色顯示，WT組蟲卵肉芽腫周圍的總膠原含量顯著高于IGTP-/-組和IRG-47-/-組。 2、在日本血吸蟲感染急性期，mG-47-/-小鼠的細胞免疫應答水平低于IGTP-/-小鼠和WT小鼠，IGTP-/-、鼠較WT小鼠有所增強。血清中細胞因子檢測顯示，IGTP4-/-小鼠和WT小鼠在感染急性期能夠產生大量的Th1/Th2型

11、細胞因子，且IGTP-/-小鼠較WT小鼠產生較多的GM-CSF和IL-2。但是，IRG-47-/-小鼠產生的細胞因子，無論是Th1型還是Th2型，都顯著低于IGTP-/-小鼠和WT小鼠。脾淋巴細胞以可溶性蟲卵抗原(SEA)或ConA刺激后檢測上清中的細胞因子顯示，在特異性抗原和有絲分裂原刺激下，IGTP-/-小鼠脾臟淋巴細胞產生的IL-12P70、TNF-α、IFN-γ/、GM-CSF、IL-5和IL-10的水平均較WT小鼠顯著增高。I

12、RG-47-/-組與WT組相比，在ConA刺激下，IRG-47-/-組脾淋巴細胞產生IL-12p70和I-10水平高于WT組，余細胞因子在兩組間無顯著性差異。 3、就產生成蟲特異性IgG抗體的能力而言，IGTP-/-小鼠略強于IRG-47-/-小鼠和WT小鼠。隨著日本血吸蟲感染的發(fā)展，三組小鼠血清中日本血吸蟲特異性IgG抗體水平均持續(xù)升高。在日本血吸蟲急性感染期，針對可溶性成蟲抗原(SWAP)特異的IgG抗體水平，在IGTP-/

13、-組小鼠顯著高于IRG-47-/-組和WT組；針對可溶性蟲卵抗原(SEA)特異的IgG抗體水平，在三組小鼠間均無顯著性差異。 4、 irg47基因缺失后可能存在igtp和ιrg47基因的交叉調控。從感染后3w到6w，在WT小鼠的巨噬細胞中，igtp和ιrg47基因的表達有下降趨勢，而irg47基因變化較小。在IGTP-/-小鼠的巨噬細胞中，ιrg47和irg47基因表達下調。相反，在IRG-47-/-小鼠的巨噬細胞中，igtp基

14、因的表達變化較少，而ιrg47基因的表達明顯上調。這提示IRG-47缺失后可能存在igtp和ιrg47基因的交叉調控，而IGTP缺失則不存在。 5、 igtp或irg47基因缺失不影響巨噬細胞發(fā)育成熟。隨著日本血吸蟲感染的發(fā)展，巨噬細胞表面分子MHC-Ⅱ類(I-A)、CD16/32、CD40和CD80，無論是在基因敲除小鼠還是野生型小鼠的表達均明顯上升。在感染前和感染后3w，IGTP-/-組CDl6/32和CD40的表達均較IR

15、G-47-/-組和WT組高；在感染后6w，三組間各分子標記的表達均無顯著性差異。巨噬細胞表面分子的表達類型提示，在日本血吸蟲感染早期，igtp基因缺失時，可能增強巨噬細胞CD16/32(FcγⅢ/Ⅱ)介導的抗原遞呈處理能力。 6、在日本血吸蟲感染急性期，巨噬細胞產生炎癥因子NO的潛能不受IGTP和IRG-47缺失的影響。在日本血吸蟲感染前，不論有無LPS刺激，各組巨噬細胞產生的NO均無顯著差異。在感染后6w，無任何刺激的情況下，

16、IGTP-/-組的巨噬細胞較IRG-47-/-組和WT組的巨噬細胞產生更高水平的NO；而以LPS刺激后三組巨噬細胞產生N0水平無顯著性差異。 7、感染活化的巨噬細胞與血清體外協(xié)同殺傷童蟲試驗顯示，IGTP-/-組的童蟲死亡率顯著高于WT組。預試驗結果表明，感染活化的巨噬細胞協(xié)同日本血吸蟲感染血清或青蒿琥酯化療血清具有殺傷童蟲活性。以日本血吸蟲感染IGTP-/-、IRG-47-/-和WT小鼠6w的巨噬細胞和相應的血清體外協(xié)同殺傷童

17、蟲試驗顯示，IGTP-/-組的童蟲死亡率為37.5％，明顯較WT組(29.41％)高。IGTP-/-組的高童蟲死亡率可能與其血清中針對日本血吸蟲成蟲特異性IgG抗體水平較高有關。 綜上，在日本血吸蟲急性感染期，IGTP-/-小鼠和IRG-47-/-小鼠在感染/致病結局、整體免疫應答，以及巨噬細胞功能等方面均存在明顯的差異，提示不同p47 GTP酶(IGTP，IRG-47)在宿主建立對日本血吸蟲感染抗力過程中可能發(fā)揮著不同的作用。